Clcn1 選択的スプライシングの修正により、筋強直性ジストロフィーマウスの筋線維タイプの移行が逆転する

Nature Communications volume 14、記事番号: 1956 (2023) この記事を引用

1734 アクセス

51 オルトメトリック

メトリクスの詳細

筋強直性ジストロフィー 1 型 (DM1) では、筋塩化物チャネル Clcn1 の調節が解除された選択的スプライシングが、反復的な活動電位による筋肉の遅延弛緩であるミオトニーを引き起こします。 成人DM1の衰弱の程度は、酸化性筋線維の頻度の増加と関連しています。 ただし、DM1 における解糖系から酸化的線維型への移行のメカニズムとミオトニーとの関係は不明です。 ここでは、DM1 の 2 つのマウス モデルを交配して、進行性の機能障害、重度の筋緊張、および 2B 型解糖線維のほぼ欠如を特徴とするダブル ホモ接合性モデルを作成します。 Clcn1 エクソン 7a の標的スキッピングに対するアンチセンス オリゴヌクレオチドの筋肉内注射は、Clcn1 選択的スプライシングを修正し、解糖系 2B レベルを頻度 40% 以上に増加させ、筋損傷を軽減し、対照オリゴによる治療と比較して線維肥大を改善します。 我々の結果は、DM1における線維タイプの移行が筋緊張に起因し、可逆的であることを実証し、DM1に対するClcn1標的療法の開発を裏付けるものである。

筋強直性ジストロフィー 1 型（筋強直性ジストロフィー; DM1）は、成人で最も一般的な筋ジストロフィーです。 この多系統障害の特徴には、ミオトニー、進行性の衰弱、心臓伝導遅延、疲労、睡眠障害、胃腸機能不全などがあります1。 DM1 は、DMPK 遺伝子の 3' UTR の拡張された CTG リピートによって引き起こされます2。 DM1 の臨床的特徴は、罹患組織の核封入体に蓄積する拡張 CUG (CUGexp) リピートを含む DMPK 転写物の発現から生じます 3、4、5、6。 この病原性 RNA は、選択的スプライシング、遺伝子発現、転写物の安定性、選択的ポリアデニル化の正常な調節に必要なマッスルブラインド様 (MBNL) ファミリーのタンパク質に容易に結合し、MBNL タンパク質の機能の部分的な喪失を引き起こします 7、8、9、10。 11.

ミオトニーはDM1の特徴であり、随意収縮後の弛緩が遅れることによって生じる筋肉の硬直を指します。 DM1 では、筋塩化物チャネル Clcn1 pre-mRNA の調節が解除された選択的スプライシングが筋緊張を引き起こします 12,13。 Clcn1 エクソン 7a が異常に含まれると読み枠がシフトし、エクソン 7 に中途終止コドンが生じ、機能性が低下した切断されたタンパク質が生成されます。 対応する塩化物イオンコンダクタンスの欠如により、過剰興奮と筋活動の不随意持続が引き起こされます 12,14。

骨格筋は個々の筋線維で構成されています。 ミオシン重鎖 (MyHC) アイソフォームの発現は、筋線維の構造、機能、代謝表現型の便利な指標として機能します 15。 MyHC 繊維タイプ 1 および 2 A は酸化酵素が豊富で、疲労に強く、継続的な活動に特化しています。 MyHC 繊維タイプ 2X および 2B は解糖代謝、すぐに疲労するという特徴があり、一過性の活動に特化しています。 げっ歯類では、タイプ 2X 線維は中程度から高レベルの酸化酵素コハク酸デヒドロゲナーゼも含み、2A 線維と 2B 線維の中間の疲労耐性を示します 16,17。 筋線維のピーク力学パワーは、MyHC 1 < 2 A < 2X < 2B15 の順に増加します。

筋線維のタイプのプロファイルは主に神経活動によって決定され、神経またはホルモンの影響に応じて変化する可能性があります15。 神経入力とは独立して起こる筋線維の固有の収縮も、線維の種類の変化と関連しています。 例えば、先天性ミオトニーの立ち直り発達抑制（Adr）マウスモデルは、Clcn1遺伝子のホモ接合型機能喪失変異によりミオトニーを発症し、ほとんどの筋肉で酸化性線維が優勢であることを特徴とする18。一方、化学的に誘導された実験的ミオトニーはシフトした。ラットにおける解糖系から酸化系までの繊維タイプ19。 ヒト DM の断面研究では、筋力低下の程度は 1 型酸化性線維萎縮と、機械的に強力ではない酸化性線維の割合の増加に関連しており、これは線維タイプの移行または解糖性線維の優先的喪失を反映している可能性があります 20,21。 この研究では、DM1の二重ホモ接合モデルとアンチセンスオリゴヌクレオチドエクソンスキッピングを使用して、Clcn1の調節解除された選択的スプライシングがDM1の解糖系から酸化的線維型への移行を誘導するという仮説を検証しました。

DM1 のヒト骨格アクチン長リピート (HSALR) マウス モデルには、ヒト骨格アクチン (ACTA1) 導入遺伝子の 3' UTR に拡張された CTG リピートが含まれています。 HSALR 株 LR41 は、HSALR 株 LR20b よりも導入遺伝子のコピー数が低く、ACTA1-CUGexp RNA 量が少なく、選択的スプライシングの調節が緩やかで、筋緊張の頻度が低く (筋電図検査/EMG で調べたマウスの 40%)、ミオパシーが軽度であるという特徴があります 12,22 。 DM1 の筋盲様 1 ノックアウト (Mbnl1-/-) マウス モデルは、Mbnl1 エクソン 3 のホモ接合性欠失を特徴とし、LR41 や LR20b8、23、24 よりも高度に調節解除された選択的スプライシングと筋緊張を引き起こします。

LR20b モデルと Mbnl1-/- モデルの以前の比較では、MBNL1 タンパク質の機能喪失は調節解除された選択的スプライシングの >80% を説明できるが、CUGexp RNA9 によって開始される転写変化の約 50% のみを説明できることが判明しました。 CUGexp RNA が MBNL1 の機能喪失とは独立して筋組織に病原性効果を誘導するという仮説を検証するために、LR41 トランスジェニック モデルと Mbnl1-/- モデルを掛け合わせて、LR41;Mbnl1-/- のダブル ホモ接合性モデルを作成しました。 DM1 (補足図1;「方法」を参照)。 LR41;Mbnl1-/- ダブルホモ接合性マウスは、尾の付け根を軽く握ると後肢で悪化する可能性のある顕著な重度の筋緊張症を経験します（補足ムービー1）。 対照的に、この操作はホモ接合性 LR41 同腹子では目に見える筋緊張を誘発できませんが、LR20b での目に見える筋緊張は比較的軽度です (補足ムービー 2)。 機能障害を定量化するために、生後 1.5 ～ 2.5 か月、3.5 ～ 4.5 か月、および 6 ～ 7 か月の 3 つの年齢グループで、アクリルケージと赤外線レーザー 25 を使用して、x、y、z 平面の自発活動を 30 分間モニタリングしました。数か月。 LR;Mbnl1-/- マウスでは、自発的活動は、年齢が一致したLR41同腹子よりも大幅に低く、年齢とともに徐々に悪化しました（図1a、補足図1）。 平均垂直休憩、つまり各イベント間に 1 秒の単一立ち上げイベントの数は、最年少年齢では同様でしたが、LR;Mbnl1-/- は中年期で 31% 減少し、最年長期では 89% 減少しました。一方、平均垂直カウント、つまり Z 面センサーからの合計カウントは、調べた最年少から最年長の年齢において、LR;Mbnl1-/- でそれぞれ 32%、55%、および 95% 減少しました。 LR;Mbnl1-/-では、総移動距離は最年少から最年長まで31%、47%、59%減少しましたが、休憩時間は生後1.5～2.5か月児で33%長く、3.5か月児では2倍以上でした。 –生後4.5か月の場合は3倍以上、生後6～7か月の場合は3倍以上になります。

HSALR 系統 41 (LR41) トランスジェニック モデルと Muscleblind-like-1 ノックアウト (Mbnl1-/-) モデルを交配して、DM1 の LR41;Mbnl1-/- ダブル ホモ接合性モデルを作成しました。 a LR41;Mbnl1-/-、LR41同腹子、およびMbnl1-/-単独における自発活動の定量化。垂直方向の休憩、垂直方向のカウント、合計移動距離（cm）、および休息に費やした時間（秒、秒）として。 生後1.5〜2.5か月（各グループN = 7または8）、3.5〜4.5か月（各グループN = 6または7）、および6〜7か月（各グループN = 8または9）のマウスを検査しました。 。 個々のマウスごとに 3 回の 30 分間のモニタリング セッションの値の平均が示されています。 ****P < 0.0001; ***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05 (一元配置分散分析)。 エラーバーは±sem b 未処理の生後 2 ～ 4 か月の LR41 の腓腹筋組織におけるミオシン重鎖タイプ 1 (MyHC 1)、2A (MyHC 2 A)、および 2B (MyHC 2B) の免疫蛍光 (IF) 分析を示します。 ;Mbnl1-/- (N = 5)、Mbnl1-/- (N = 6)、LR20b (N = 6 および WT コントロール (N = 4)。それぞれの代表的な画像を示します。蛍光強度は 0 ～ 10,000 グレー スケールです。マージ画像では、MyHC 1 は黄色、MyHC 2 A は緑色、MyHC 2X 黒 (未標識)、MyHC 2B は赤色です。サイズ バーは 20 μm を示します。 c 未処理の腓腹筋における MyHC タンパク質発現タンパク質発現の IF 定量化2〜4か月齢のLR41;Mbnl1−/−（N = 5）、Mbnl1−/−（N = 6）、LR20b（N = 6）、および野生型（WT）コントロール（N = 4）。 ****P < 0.0001; **P < 0.01; *P < 0.05 (一元配置分散分析)、エラーバーは±sem を示します ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、疾患の重症度の増加の説明として、MBNL1 タンパク質の欠如が CTG リピート長に影響を与えるかどうかを調べました。 以前に我々は、LR20b 系統が約 185 個の CTG リピートを持ち、加齢に伴う筋肉組織の変化を示さず、疲労やミオパシーの重症度の進行と無関係であることを実証しました 25。 CTG リピート長は、Mbnl1 遺伝子型に関係なく LR41 マウスで同様に見え、LR20b とは対照的に 2 つのバンドを示しました。 約750および575塩基対のPCRアンプリコンサイズは、それぞれ約215および160のCTGリピートに対応します（補足図1）。

以前の研究では、筋肉組織のMBNL1タンパク質とMBNL2タンパク質の両方が遺伝的に減少しているマウスは、MBNL1タンパク質またはMBNL2タンパク質のいずれかが単独で欠如している場合よりも重篤なDM1様の特徴を発現することが判明しており、MBNLタンパク質の複合的損失が原因であるというモデルを裏付けています。 DM1 の発症における重要なステップ26。 LR41;Mbnl1-/- におけるより重篤な表現型の媒介における MBNL2 タンパク質の潜在的な役割を探索するために、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション、免疫蛍光 (FISH/IF)、および大腿四頭筋の定量的イメージングを実行しました。 LR41;Mbnl1-/-では、LR41同腹子対照と比較して、CUGexp RNA核病巣はより少ない筋核で明らかであり、存在する場合でも強度は弱かった（補足図2）。 MBNL2タンパク質はLR41;Mbnl1-/-においてCUGexp RNAと共局在し、MBNL2タンパク質の全体的なレベルはLR41またはWT対照よりも筋核および間質細胞で高いように見えた。

DM1 マウスモデルにおける筋緊張の重症度と筋線維の酸化状態との関係を決定するために、まず、重度 (LR41;Mbnl1-/-)、中等度 (Mbnl1-/-)、軽度 (Mbnl1-/-) のマウスの腓腹筋の免疫蛍光分析を実行しました。 LR20b)、ミオシン重鎖タイプ 1 (MyHC 1)、MyHC 2 A、および MyHC 2B に特異的な抗体を使用した筋緊張症 (WT) はありません。 MyHC 2X ファイバーは標識されていないままでした。 LR41;Mbnl1-/- では、MyHC 2 A および 2X 線維の頻度は Mbnl1-/- よりも 60% 高く、LR20b よりも 2 ～ 3 倍高く、WT よりも 4 倍高かった (P < 0.01および<0.0001）、MyHC 2Bの頻度はMbnl1-/-よりも3倍低く、LR20bよりも4倍低く、WTコントロールよりも5倍低かった（P <0.0001;図1c） 。 抗 MyHC 2A 抗体による標識強度はすべてのグループで変動し、一部のファイバーは明るいシグナルを示し、他のファイバーは明るい 2A ファイバーと非標識 2X ファイバーの間の中間シグナルを示しました。

以前の研究で、我々は、トレッドミル歩行運動と ACTA1-CUGexp 転写物を標的とする ASO 治療を 3 か月間組み合わせると、老齢 LR20b マウスの疲労が回復することを発見しました 25。 慢性的な運動は筋線維のタイプの移行と関連しています15。 例えば、運動をしなかったマウスと比較して、4週間自発的に輪行運動を行ったマウスでは、タイプ2A線維の割合が高く、2B線維の割合が低かった27。 DM1 マウスにおける MyHC 線維タイプの移行が可逆的である可能性を調べるために、全身性 ACTA1-CUGexp 標的 ASO および/または 3 か月の運動トレーニング プログラムで治療された老齢 LR20b マウスの腓腹筋を調べました 25。 ASOを投与された老齢マウスでは、生理食塩水で処理した対照よりもMyHC 2Xの頻度が約50％低く、2Bの頻度が25％高く（ P < 0.05）、全体的な線維タイプの分布はWTと同様に見えました（補足図3） ）。 私たちの運動トレーニング計画は、老齢 LR20b マウスの MyHC 発現パターンに影響を与えませんでした。

Clcn1 選択的スプライシングの調節解除とその結果生じる筋緊張が DM1 マウスの線維型移行の原因であるという仮説を検証するために、Clcn1 エクソン 7a24 の標的スキッピングを誘導する ASO を前脛骨筋 (TA) に注射しました。 LR41;Mbnl1-/- では、RT-PCR 分析により、16 ～ 18 日間の ASO 治療により、エクソン 7a の含有量が、同一であるが 5' 末端を持つコントロール オリゴ (インバート) を注射された対側筋肉と比較して、60% 近く減少することが明らかになりました。 -3'逆位配列（P < 0.0001;図2a、b）。 52 日間の治療後、LR41;Mbnl1-/- におけるエクソン 7a の包含は、対照治療筋肉よりも Clcn1 ASO 治療の方が依然として 40% 低く、LR20b では WT と同様に見えました (それぞれ P < 0.0001 および < 0.01)。 。

LR41;Mbnl1-/- (N = 10) および LR20b (N = 4) の前脛骨筋 (TA) 筋に、Clcn1 エクソン 7a (+) のスキッピングを誘導するように設計されたアンチセンス オリゴヌクレオチド (ASO) を注射しました。 対側の TA には、同一であるが 5'-3' 逆配列を持ち、標的を持たないコントロール オリゴ (-) を注入しました。 未処理の野生型 (WT) マウス (N = 4 または 5) を対照として使用しました。 治療期間は 16 日間または 18 日間 (16-18d) または 52 日間 (52d) でした。 52日間治療した筋肉におけるClcn1エクソン7a、Atp2a1エクソン22、Clasp1エクソン20、Ttnエクソン346、およびCacna1sエクソン29の選択的スプライシングの代表的なRT-PCR分析。 bp 塩基対、lad DNA ラダー。 b RT-PCRによるClcn1選択的スプライシングの定量。 ****P < 0.0001; **P < 0.01; (一元配置分散分析)。 c 52日間の治療後のAtp2a1、Clasp1、Ttn、およびCacna1の選択的スプライシングの定量化。 **P < 0.01; (一元配置分散分析)。 d Clcn1 選択的スプライシングの液滴デジタル PCR (ddPCR) 分析。 ****P < 0.0001; (一元配置分散分析)。 e ddPCR (黒) および RT-PCR (オレンジ) による Clcn1 エクソン 7a 包含の定量化。 f ddPCR (x 軸) および RT-PCR (y 軸) による Clcn1 エクソン 7a 包含の定量化。 ピアソン相関係数 r と P 値が表示されます。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

Clcn1 ASO の特異性を確認するために、DM1 患者およびマウスモデルで調節が解除されている他の転写産物の選択的スプライシングを調べました 8、28、29、30。 LR41;Mbnl1-/- マウスでは、転写物 Atp2a1、Clasp1、Ttn、および Cacna1s のスプライス イベントは、治療または期間に関係なく同様に見えました (図 2c)。 LR20b マウスでは、Clasp1、Ttn、および Cacna1s のスプライス イベントは ASO 処理筋とインバート処理筋で同様に見えましたが、Atp2a1 は予想外に Clcn1 ASO 処理筋のスプライシング パターンの悪化を示しました。

Clcn1 選択的スプライシングの検出に使用される RT-PCR プライマーは、単一のエクソン 7a 除外産物 (345 bp) と 3 つのエクソン 7a 包含産物 (424、約 550、および約 850 bp) を増幅します12。 標準的な RT-PCR およびバンド濃度測定を使用すると、増幅前の転写物の化学量論や PCR 産物の長さの違いにより、より短い産物が優先的に増幅されるため、エクソンスキッピングが過大評価される可能性があります 31。 あるいは、より長い PCR 産物へのインターカレート核酸色素の結合が大きいと、より短い産物よりも明るいシグナルが得られ、その結果、エクソンスキッピングが過小評価される可能性があります 32。 最近の多施設研究では、スプライスシフト ASO 活性の定量化に関しては、液滴デジタル PCR (ddPCR) が RT-PCR/バンドデンシトメトリーよりも正確であることが判明しました 33。 エクソンインクルージョンの定量化方法を比較するために、Clcn1 エクソン 7a インクルージョンを定量化するための ddPCR アッセイを開発しました。 ddPCRを使用すると、逆オリゴ処理筋肉と比較して、LR41;Mbnl1-/- ASO処理筋肉では16〜18日でエクソン7aの含有率が50％低く、52日では28％低かった（図2d、3;補足）図4）。 LR41;Mbnl1-/- では、ddPCR によるエクソン 7a 包含の推定は RT-PCR によるものより一貫して高く、WT ではその逆が当てはまりましたが、2 つの方法は強い相関を示しました（Pearson r = 0.96; P < 0.0001; 図.2e、f)。

免疫蛍光を使用して、いずれかで処理した LR41;Mbnl1-/- (N = 7) および LR20b (N = 4) の前脛骨筋 (TA) 筋における MyHC 1、MyHC 2 A、MyHC 2X、および MyHC 2B タンパク質発現を定量しました。 Clcn1 ASO (+) または逆オリゴ (-)。 未処理の野生型 (WT; N = 4) TA 筋肉をコントロールとして使用しました。 a Clcn1 ASO または逆オリゴで 18 日間処理した LR41;Mbnl1-/- の代表的な画像。 蛍光強度は 0 ～ 20,000 グレースケール単位です。 マージ イメージでは、MyHC 1 は黄色、MyHC 2A は緑色、MyHC 2X は黒色 (ラベルなし)、MyHC 2B は赤色に色付けされています。 サイズバー = 100 μm。 b 16〜18日間または52日間処理したTA筋肉および未処理のWTコントロールにおけるMyHC 1、2A、2X、および2B線維の定量化。 ****P < 0.0001; **P < 0.01; *P < 0.05 (一元配置分散分析)。 c LR41におけるMyHC 2 A、2X、および2B発現の時間経過;逆オリゴ(青)またはClcn1 ASO(オレンジ)で処理したMbnl1-/- TA筋肉。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

筋線維の酸化状態に対する Clcn1 ASO の影響を調べるために、MyHC タンパク質の定量的免疫蛍光を実行しました。 コントロールオリゴで処理したLR41;Mbnl1-/-筋肉では、MyHC 2Aが60％を超えて優勢でしたが、2B線維はほとんど存在しませんでした（図3a〜c）。 対照的に、Clcn1 ASO で治療した筋肉では、MyHC 2 A は治療 16 ～ 18 日までに 50% 未満、52 日後には約 20% でした (それぞれ P < 0.05 および <0.0001)、MyHC 2B は 40% でした。各時点で (P < 0.0001)。 MyHC 2X の頻度は、16 ～ 18 日までにベースラインの約 35% から 15% に低下し (P < 0.01)、52 日後には 40% に上昇しました。 Clcn1 ASOで処理したLR20b筋肉では、逆オリゴ処理対照よりもMyHC 2Xの頻度が低く、MyHC 2Bの頻度が高かったが、両方とも統計的に有意ではなかった一方、MyHC 2Aの頻度は野生型と同様に見えた。 MyHC 1 は、すべての実験グループおよび野生型コントロールで低いか、または存在しませんでした。

正常にスプライスされた Clcn1 転写物のタンパク質産物である ClC-1 は、Clcn1 ASO 処理筋肉のいくつかの MyHC 2 A、2X、および 2B 線維の筋鞘で明らかでしたが、逆オリゴ処理筋肉には存在しませんでした (図 4)。 。 野生型対照では、ClC-1 の筋鞘シグナルは、MyHC タイプ 2 A および 2X 線維の方が 2B 線維よりも強いようでした。 細胞質免疫蛍光シグナルも、逆オリゴ処理筋肉と比較して、Clcn1 ASO 処理筋肉および野生型筋肉でより高いように見えました。

CLC-1、MyHC 2A、およびMyHC 2Bタンパク質を標的とする抗体を使用して、LR41;Clcn1 ASOまたは反転オリゴで16日間処理したMbnl1-/-および未処理のWTコントロール（各グループN = 4）のTA筋肉を標​​識しました。 それぞれの代表的な画像を示します。 蛍光強度は 0 ～ 20,000 グレースケール単位です。 マージ画像では、ClC-1 は黄色、MyHC 2A は緑色、MyHC 2X は黒色 (ラベルなし)、MyHC 2B は赤色で色付けされています。 WT 画像では、2A または 2X ファイバーと比較して 2B ファイバーの膜で明らかな低い ClC-1 強度を強調するために、「+」は 2A ファイバーを示し、「*」は 2X ファイバーを示します。 サイズバー = 50 μm。

筋肉損傷後、胚性ミオシン Myh3 の発現は、成体ミオシン アイソフォームに置き換えられる前に、新しく再生された線維内で一時的に上方制御されます。 ミオシン転写レベルに対する治療効果を確認するために、ddPCR を使用して遺伝子 Myh2 (MyHC 2 A)、Myh1 (MyHC 2X)、Myh4 (MyHC 2B)、および筋損傷マーカー Myh3 (MyHC-emb) の RNA 発現を定量しました。 。 4 つの転写産物のコピー/μl データを使用して、個々の転写産物の発現パーセントを計算しました。 野生型TA筋肉では、総ミオシン遺伝子発現のMyh2は1%未満、Myh1は約20%、Myh4はほぼ80%でした（図5a、b）。 LR41;Mbnl1-/- では、Clcn1 ASO による治療により、Myh2 レベルがほぼ 20% から 5% 未満に低下し (P < 0.0001)、Myh1 レベルがほぼ 80% から約 50% に低下しました (P < 0.0001 および <0.01)。逆オリゴ処理した筋肉と比較して、Myh4 は 4% 未満から 45% まで 13 倍増加しました (P < 0.0001)。 LR20bでは、Clcn1 ASOによる治療は、反転対照オリゴ治療筋と比較して、Mhy1を36%から16%に減少させ(P<0.05)、Myh4を63%から83%に増加させた(P<0.05)が、Myh2は関係なく1%未満のままであった。治療の。 Clcn1エクソン7aの組み込みは、ddPCRによるミオシン遺伝子発現と強い相関があります（r = 0.80、0.91、および-0.93; P < 0.0001;図5c）。 Clcn1 標的化 ASO で治療した筋肉では、筋損傷マーカー Myh3 の発現が対照で治療した筋肉より 70 ～ 80% 低く (P < 0.01)、Clcn1 選択的スプライシングとも相関していました (r = 0.74; P < 0.0001)。 (図 5d–f)。

a ddPCRを使用して、LR41のTA筋肉におけるMyh2（左; MyHCタイプ2 A）、Myh1（中央; MyHCタイプX）、およびMyh4（MyHCタイプ2B）の遺伝子発現をコピー/μl cDNAとして定量しました;Mbnl1-/- Clcn1 ASO (+) または反転オリゴ (-) で 16、18、または 52 日間治療した (N = 10) および LR20b (N = 4) マウス。 未処理の野生型 (WT; N = 5) TA 筋肉をコントロールとして使用しました。 b a）のコピー/μlデータを使用して、LR41のMyh2（左）、Myh1（中央）、およびMyh4（右）の総ミオシン転写物のパーセンテージ（％）を計算しました;Mbnl1-/-（N = 10） 、LR20b (N = 4)、および WT (N = 4)。 c LR41;Mbnl1-/-（N = 10）とWT (N = 4)。 それぞれのピアソン相関係数 r と P 値が表示されます。 d LR41;Mbnl1-/- (N = 10)、LR20b (N = 4)、および WT (N = 5) における筋肉再生のマーカーである胎児ミオシン Myh3 (MyHC-emb) 遺伝子発現の定量化。 e LR41;Mbnl1-/- (N = 10)、LR20b (N = 4)、および WT (N = 5) における総ミオシン遺伝子発現のパーセンテージとしての Myh3 発現。 f LR41;Mbnl1-/- (N = 10) および WT (N = 4) の個々のサンプルにおける総ミオシンのパーセンテージ (y 軸) としての Clcn1 エクソン 7a 包含の ddPCR 定量化 (x 軸) と Myh3 の関係 (y 軸)。 それぞれのピアソン相関係数 r と P 値が表示されます。 ****P < 0.0001; ***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05 (一元配置分散分析)。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

次に、ミオシン転写物と対応するタンパク質との関係を調べました。 免疫蛍光によるMyHC 2 Aの頻度は、ddPCRによるMyh2遺伝子発現よりも一貫して高かったが、強い相関があった(r = 0.90; P < 0.0001)(図6a)。 Myh2 と Myh1 の組み合わせ頻度は、Myh4 転写物と MyHC 2B タンパク質と同様に、MyHC 2 A と 2X の組み合わせ頻度と強く相関しました (r = 0.93; P < 0.0001)。

a Myh2 (左)、Myh2 と Myh1 の組み合わせ (中央)、および Myh4 (右) の ddPCR による転写発現 (x 軸) と、対応するタンパク質 MyHC 2 A (左)、MyHC 2A と MyHC 2X の組み合わせの関係LR41;Mbnl1-/- (N = 7)、LR20b (N = 4)、および WT (N = 3) における免疫蛍光 (IF) (y 軸) による (中央)、および MyHC 2B (右)。 それぞれのピアソン相関係数 r と P 値が表示されます。 b MyHC 2Aおよび2Xを標的とする抗体と、Clcn1 ASOまたは逆方向オリゴのいずれかで処理したLR41;Mbnl1-/-のTA筋肉におけるMyHCタンパク質発現の免疫蛍光（IF）分析を使用しました（N = 各グループ）。 未処理の野生型 (WT) TA 筋肉 (N = 4) をコントロールとして使用しました。 それぞれの代表的な画像を示します。 蛍光強度は 0 ～ 10,000 グレースケール単位です。 マージ画像では、MyHC 2 A は緑色、MyHC 2X マゼンタ (疑似カラー)、MyHC 2B は黒 (ラベルなし) に見えます。 MyHC 2 A と MyHC 2X の両方の信号を示すファイバーは、MyHC 2 A/2X ハイブリッド ファイバーです。 サイズバー = 100 μm。 c LR41で2Xを含まない2A（純粋な2A;左）および2Xを共発現する2A（2A / 2Xハイブリッド）を発現する繊維全体の定量（％）;Clcn1 ASO（+）のいずれかで処理したMbnl1-/- ）または逆オリゴ（−）および未処理のＷＴコントロール（−）（各グループＮ＝４）。 d 純粋なMyHC 2A（左）、2A/2Xハイブリッド（左中央）、2X（中央右）、および2B（右）の％頻度としての定量化（各グループN = 4）。 ****P < 0.0001; ***P < 0.001; **P < 0.01 (一元配置分散分析)。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

我々は、腓腹筋におけるものと同様に、LR41;Mbnl1-/- TA筋肉におけるMyHC 2 Aの免疫標識の強度が変動することを観察した。 ハイブリッド線維には、2 つ以上の MyHC アイソフォームの混合組成が含まれており、線維タイプの変換が行われている筋肉に頻繁に見られます 15。 以前の研究では、ヒト DM 筋肉において複数のミオシン アイソフォームを発現する個々の線維の割合が増加していることも示されています 34、35、36。 MyHC 2 A の可変標識強度および/または MyHC 2 A タンパク質と Myh2 RNA の不一致がハイブリッド線維の存在を示す可能性を探るため、本発明者らは、MyHC 2 A と MyHC 2 A の両方を標的とする抗体で TA 筋組織切片を同時標識した。 2倍。 LR41;Mbnl1-/- では、治療に関係なく、MyHC 2 A を発現する線維の半分以上が MyHC 2X も発現します（図 6b-d）。 純粋な 2A および 2A/2X ハイブリッド線維は、逆オリゴを投与された筋肉と比較して、Clcn1 ASO を投与された筋肉では約 70% 減少しました。 調べたWT TA筋肉では、合計2A線維の約半分が2A/2Xハイブリッドでした。

DM1 を患う成人では、酸化性および解糖性の筋線維のサイズが 20 歳代から 50 歳代にかけて増加します 21。 LR41;Mbnl1-/- マウスの筋線維サイズに対する重度の筋緊張の影響を決定するために、TA 筋組織切片の最小フェレ径 37 を測定しました。 インバートコントロールオリゴで治療した筋肉では、すべての線維タイプのサイズ分布が肥大に向かってシフトし、MyHC 2A 線維の平均直径は 75% 大きく (P = 0.0002)、MyHC 2X は 40% 大きくなりました (P = 0.004)。 、およびMyHC 2Bは、野生型対照筋肉よりも20％大きかった（有意ではない）（図7a、b）。 Clcn1 ASO による治療は、サイズ分布をシフトさせ、反転コントロール オリゴで処理した筋肉と比較して、MyHC 2A 線維の平均直径を約 12%、2X 線維の平均直径を 16% 減少させ、2B 線維の直径を野生型の値に回復させました (P = 0.028)。

a Clcn1 ASOまたは逆オリゴで処理したLR41;Mbnl1-/-の前脛骨筋（TA）筋線維の平行接線間の最小距離として定義される最小フェレ径37を測定しました（各N = 4）。 未処理の野生型 (WT; N = 3) をコントロールとして使用しました。 直径は、MyHC 2 A (左上)、MyHC 2X (右上)、および MyHC 2B (左下) ファイバーの周波数 % として表示されます。 b a) のデータを使用した平均繊維直径。 ***P < 0.001; **P < 0.01; P < 0.05 (一元配置分散分析)。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

以前の研究では、Apt2a1 の選択的スプライシングは、ACTA1-CUGexp 転写レベルと治療薬活性の高感度指標として機能しました 30,38。 Clcn1 スプライシングの選択的補正が LR20b マウスにおける Atp2a1 の調節解除されたスプライシングを悪化させることを示したので、我々は次に、治療した筋肉における ACTA1-CUGexp 転写物の発現に対する Clcn1 スプライシング補正の影響を調べました。 ddPCRを使用したところ、インバートオリゴ処理対照と比較して、ACTA1-CUGexp mRNA転写レベルが16〜18日後に2倍になり、Clcn1 ASO処理52日後には65%増加したことがわかりました（それぞれP < 0.01および<0.05）。 (図8a、b)。 この mRNA 存在量の上昇が導入遺伝子の転写の増加によるものであるかどうかを調べるために、ACTA1-CUGexp pre-mRNA を測定したところ、これも上昇しており、16 ～ 18 日後および 52 日後には 55% および 70% 増加していることがわかりました。それぞれ (P < 0.05 および <0.01)。 対照的に、ヒトDM1におけるCUGexpリピート拡張を担う遺伝子であるDmpkの発現は、治療に関係なく筋肉内で同様に見えた（図8c）。

a ddPCRを使用して、Clcn1 ASO（+）またはオリゴ (-) を cDNA あたりのコピー数として反転します。 未処理の WT TA 筋肉 (-) (N = 4) をコントロールとして使用しました。 b a）のコピー/μl cDNAデータを使用して、LR41;Mbnl1-/-（N = 10）のマウスActa1に対するACTA1-CUGexp mRNA（左）およびACTA1-CUGexp pre-mRNA（右）の発現を正規化しました。 **P < 0.01; *P < 0.05 (一元配置分散分析)。 c 処理された筋肉におけるDmpk発現のddPCR定量化（コピー/μl cDNAとして）（左）、Acta1（右）、n LR41;Mbnl1-/-（N = 10）およびWT（N = 4）に対して正規化しました。 d Acta1に正規化されたACTA1-CUGexp mRNAと％Myh2（左）、Myh1（中央）、およびMyh4（右）遺伝子発現（x軸）との関係、およびe LR41のACTA1-CUGexpプレmRNA（y軸）との関係;Mbnl1-/- TA 筋肉 (N = 10) を 16 ～ 18 日間 (黒丸) または 52 日間 (オレンジ色の三角) 治療した。 それぞれのピアソン相関係数 r と P 値が表示されます。 エラーバーは±semを示します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

ACTA1 導入遺伝子の発現とミオシンアイソフォームの関係を決定するために、ACTA1 mRNA とプレ mRNA を Myh2、Myh1、および Myh4 転写物の存在量と比較しました。 ACTA1 mRNAおよびpre-mRNAは、Myh2（r = -0.70 mRNAおよび-0.65 pre-mRNA; P = 0.038および0.078）およびMyh1（r = -0.85および-0.81; P = 0.007および0.014）の頻度と逆相関し、相関しました。初期および後期の両方の時点で Myh4 (r = 0.89 および 0.83; P = 0.003 および 0.011) の頻度を使用します (図 8d、e)。

DM1 では、筋緊張と酸化線維は最も弱い筋肉で最も顕著になる傾向があり、反復的な活動電位が筋肉の病理に寄与する可能性があることを示唆しています。 この研究では、DM1 の 3 つのマウス モデルを使用して、慢性ミオトニーが解糖系から酸化系への筋線維タイプの移行を引き起こすこと、その移行は根本的な分子欠陥の修正によって可逆的であること、および Clcn1 の選択的スプライシングが線維タイプの割合を予測することを確立します。 DM1 マウスにおける線維タイプの移行の可逆性は、成体 DM 筋生検で観察される酸化的線維優位の原因としての解糖線維の選択的喪失に反対します 20,21。 ASO処置マウスにおける線維径の改善と筋損傷の減少は、筋緊張減少の治療上の利点を示しており、DM1に対するClcn1標的療法のさらなる開発を裏付けるものである。 早期終結コドンの除去により、Clcn1 エクソンスキッピング ASO は、ClC-1 タンパク質、機能的 ClC-1 チャネル、および塩素コンダクタンスの全体的な存在量を増加させます 24。 DM1 における特異的な抗ミオトニア治療の潜在的な臨床上の利点には、(1) 筋弛緩時間の減少、(2) MyHC 線維タイプのパターンの回復、(3) 機械的により強力な解糖線維の割合が高いことによる筋力の増加、(4)筋肉損傷の減少、(5) 線維サイズの改善、(6) 全体的な筋肉機能の強化。

病原性DMPK-CUGexp転写物を標的とするASOおよび小分子療法は、現在DM1に対して開発中である。 このアプローチの明らかな利点は、筋緊張症を含む DM1 の臨床症状のほとんどまたはすべてを単一の薬剤で治療できる可能性があることです。 潜在的なハードルは、体細胞組織における CTG リピート拡張の不安定性に関連しており、約 9000 ～ 18,000 ヌクレオチドに相当する約 3000 ～ 6000 リピートに達します 39,40,41。 したがって、MBNL タンパク質置換戦略 42 を使用して CUGexp 配列を標的とする候補アンチセンス化学では、治療効果を発揮するのに十分な MBNL タンパク質を放出するために、各 DMPK-CUGexp 転写物に結合する 25 残基のオリゴの数十コピーが必要になる可能性があります。用量制限毒性と次善の臨床効果の可能性。 切断とその後の分解のために CUGexp 配列を標的とするアンチセンス戦略には、同様に CUG リピートを含む他の遺伝子が不注意でサイレンシングされるリスクが伴いますが、リピートの外側の配列を標的とする戦略では、拡張されたリピートを含む転写産物の選択性が損なわれ、潜在的に CUG リピートを含む遺伝子がサイレンシングされる可能性があります。 DMPK対立遺伝子が拡張されていないため、ハプロ不全から生じる可能性のある臨床症状を悪化させるリスクがあります。 さらに、筋管状ミオパチーの治療を目的とした RNase H 活性 ASO の初期段階の臨床試験が、低用量での忍容性不良のため最近終了しました (clinicaltrials.gov 識別子 NCT04033159)。筋肉は難しいかもしれません。 対照的に、我々がこの研究で使用したスプライスシフトモルフォリノ化学は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療薬としてすでにFDAから承認されている4つの薬剤でヒトに対する安全性を実証している43。 いくつかの分子複合体は、骨格筋組織における複数の ASO 化学の送達と効力を促進することが期待されることが示されています 30、44、45、46、47、48、49、50。 DM1 における治療効果を高めるために、DMPK-CUGexp 転写物に向けられた薬剤をアジュバントの Clcn1 標的化 ASO と組み合わせることができます。

最近の臨床試験では、ナトリウムチャネル遮断薬メキシレチンによる6か月間治療により、DM1被験者の握力筋緊張がプラセボ治療群と比較して減少したことが示されました51。 同じ研究では、メキシレチン投与群の3ヵ月後の6分間歩行テストでも改善の可能性があり、このとき薬物は被験者の90％の血清中に検出され、メキシレチン投与後6ヵ月では有意ではない改善傾向がみられたことも判明した。被験者の 65% の血清からのみ検出可能であり、用量順守の不遵守により、後の時点での潜在的な利益が不明瞭になった可能性があることを示唆しています。 メキシレチンの半減期は比較的短いため、一般に 1 日あたり 3 ～ 4 回の投与が必要となり、長期的なコンプライアンスが制限される可能性があります。 線維型移行を逆転させるために必要な筋緊張の継続的かつ永続的な減少を可能にするのに十分な高用量のメキシレチンを達成および維持できるかどうかは不明である。 メキシレチンのもう 1 つの欠点は、心臓に対して不整脈を引き起こす効果があるため、すでに心臓伝導障害を起こしやすい DM1 患者へのメキシレチンの使用が困難になることです 52。

Clcn1 ASO で治療した筋肉で観察された ACTA1-CUGexp 転写物の量の多さは、おそらく DMPK-CUGexp の産生の増加および/または安定性の強化によって、この治療アプローチを DM1 患者に適用する際の懸念の原因であると解釈される可能性があります。骨格筋内の RNA。 これは、いくつかの理由により考えられそうにありません。(1) ASO 処理した筋肉における ACTA1-CUGexp pre-mRNA と mRNA の同程度の上昇は、ACTA1 導入遺伝子の転写増加がそのメカニズムであることを示唆しています。(2) Myh2 (2 A) および Myh1 (2X) 転写物との ACTA1-CUGexp 転写物レベル、および Myh4 (2B) との強い正の相関は、ヒト ACTA1 導入遺伝子の発現が 2B 線維でより高く、ACTA1-CUGexp RNA の増加が観察されたことを示唆しています。 ASO処理した筋肉では、線維タイプの変化に反応するヒトACTA1導入遺伝子のアーチファクトであり、(3)ヒトDM1の拡張リピートを運ぶ遺伝子であるDmpkの転写レベルは、処理した筋肉では変化していないように見え、同様の影響を及ぼしたと主張している。 Clcn1 を標的とする ASO は、DMPK-CUGexp 発現の増加につながります。 実際、より高い ACTA1-CUGexp RNA 含有量の設定で観察された治療効果は、DMPK-CUGexp 発現が安定したままであれば、DM1 患者における線維型移行の臨床的利点がさらに大きくなる可能性を示唆しています。

LR41;Mbnl1-/-で観察されたCUGexp RNAとMBNL2タンパク質の核共局在は、このモデルにおける表現型の悪化が、Mbnl1とMbnl2の遺伝的減少の組み合わせと同様に、複合MBNLの機能喪失に部分的に起因する可能性があることを示唆していますマウスにおいて26,53。 LR41;Mbnl1-/- における核封入体の強度の低下は、MBNL1 タンパク質が DM1 細胞におけるリボ核病巣の形成に重要であるという以前の報告を裏付けています 54。 さらに、いくつかの筋核に CUGexp 封入体が明らかに存在しないことは、表現型の悪化が、他の核タンパク質の結合および/または細胞質への局在化を介した CUGexp 転写物の毒性の亢進に部分的に起因する可能性も示唆しています。 LR41;Mbnl1-/- 筋肉組織の筋核および間質細胞で発見された MBNL2 タンパク質の存在量の増加は、Mbnl1-/- 筋肉における Mbnl2 mRNA およびタンパク質発現の代償的増加に関する以前の観察と一致しています 26。

筋線維内の ClC-1 タンパク質の局在については議論の余地があり、チャネルの大部分が細胞質の横尿細管系内、もっぱら筋膜に位置していること 55、または年齢とともに細胞質から膜に変化する可能性があることを裏付ける証拠 57 がある。 我々の研究での偶然の発見は、逆オリゴ処理した筋肉と比較して、LR41;Mbnl1-/- ASO処理した筋肉の細胞質と細胞膜の両方でClC-1タンパク質の発現が増加しているように見えることでした。 野生型の筋肉では、筋鞘における ClC-1 標識が 2B 線維で最も低く見えることも観察されました。2B 線維は、酸化線維よりも ClC-1 タンパク質の発現と塩化物コンダクタンスが高いと報告されています 15。

マサチューセッツ総合病院 (MGH) IACUC は、すべてのマウス研究を承認しました。 ヒト骨格アクチンロングリピート (HSALR) 系統 20b (LR20b) および系統 41 (LR41) トランスジェニックマウスモデル 22、および Mbnl1 エクソン 3 のホモ接合欠失を含む筋盲様 1 ノックアウト (Mbnl1-/-) 23 マウスモデルが、前に説明した。 我々は、物質移転契約を介して、C. Thornton 博士 (ロチェスター大学) から LR20b および LR41 トランスジェニック マウスを、M. Swanson 博士 (フロリダ大学) から Mbnl1 -/- マウスを入手しました。 すべてのマウスは FVB 遺伝的背景に基づいて維持されました。 野生型 FVB マウス (The Jackson Laboratory、系統番号 001800) を対照として使用しました。 年齢は生後7週間から18か月まででした。 すべてのマウスに標準食（照射済み Prolab Isopro RMH 3000）を自由に与え、最大 5 匹のグループで飼育しました。 照明は、標準的な 12:12 の明暗サイクルで時間制御されました。 温度と湿度はそれぞれ 20 ～ 23 °C と 30 ～ 70% で安定していました。 安楽死は、二次頚椎脱臼を伴う 5% イソフルラン麻酔薬の過剰摂取によって行われました。

我々は、LR41とMbnl1ヘテロ接合体を交配して、LR41ホモ接合体およびMbnl1ヘテロ接合体であるマウス(LR41;Mbnl1+/-)を作製し、交雑したLR41;Mbnl1+/-マウスから二重ホモ接合性LR41;Mbnl1-/-マウスを作製した。 離乳時に尾部生検を実施し、市販の組織/血液 DNA 単離キット (Qiagen 製品番号 69506) を使用して生検標本からゲノム DNA を単離しました。 ACTA1 導入遺伝子の接合性を決定するために、同じ反応で 1 つはマウス Acta1 に特異的で、もう 1 つはヒト ACTA1 に特異的な 2 セットのプライマーを使用した PCR アッセイと、ACTA1/Acta1 比を計算するための定量的バンド濃度測定を使用しました。 Mbnl1 エクソン 3 欠失対立遺伝子を検出するために、我々は以前に公開されたプロトコール 23 を修正しました。このプロトコールでは、共通の左プライマーと別個の右プライマーを別々の PCR 反応で使用し、1 つは Mbnl1 エクソン 3 欠失を検出し、もう 1 つは野生型対立遺伝子を検出します。 プライマー配列を補足表 1に示します。

以前に公開されたプロトコール 25 を使用して、100 ng のゲノム DNA を制限酵素 HindIII-HF (New England Biolabs 製品番号 3104) で消化し、10 ng の消化した DNA を CTG リピート挿入にまたがるプライマーを用いた PCR のテンプレートとして使用し、次の方法で PCR 産物を分離しました。 1.5% アガロースゲル電気泳動、1 × SYBR I グリーン核酸ゲル染色 (Life Technologies 製品番号 S7567) を使用してゲルを染色し、CTG リピートの長さから CTG リピートの上流および下流のプライマーによって増幅されたヌクレオチドの数を差し引くことによって推定された CTG リピート長総アンプリコン サイズを 3 で割ります。

以前に公開したプロトコル 25 を次のように変更しました。 すべてのマウスは、試験時に行動的に最も活発になるように夜間に試験され、少なくとも1時間は試験室に順応させた。 2 つのセットの個別のチャンバーを使用し、隔離された部屋で毎日同じ時間に、同じハンドラー (Opto-Varimex 4 活動量計; Columbus Instruments, Inc) を使用して 30 × 1 分間隔で自発的活動をモニタリングしました。 このシステムは、動物室を前後左右に横切る不可視の赤外光ビームのグリッドを使用して、XYZ 平面内のマウスの位置と動きを監視します。 センサー ペアは、8 つの赤外線ビームを備えた赤外線エミッター バーと、それに対応する検出バーで構成されます。 最適なビームの 1 つが遮断されるたびに、カウントとして記録されます。 垂直方向のカウントは、Z 軸センサーからの合計カウントです。 垂直休憩は、各イベントの間に 1 秒間の単一の立ち上がりイベントです。 歩行時間は、大きな歩行動作に費やした合計時間を秒単位で定量化したものです。 静止時間は、動きが検出されなかった合計時間 (秒) として定義されます。 常同時間 (秒) は、引っ掻く、身づくろい、またはその他の歩行以外の常同的な動きなど、小さな素早い動きに費やされる合計時間を定量化したものです。 インターバル中に移動した合計距離はセンチメートル (cm) で記録されます。 各パラメーターについて、グループ間の比較のために、3 つの別々の日に 3 つの別々の試験の平均値を使用しました。

生後 14 ～ 14.5 か月の HSALR マウスを、速度調整可能な可変速ベルト トレッドミル (Exer 3/6; Columbus Instruments, Inc.) を使用して平らな場所 (傾斜なし) で運動させ、まず 3 m/min で 2 分間の順応から始めました。 、1 分間で 3 m/min から 11.5 m/min まで加速し、その後 11.5 m/min で 30 分間、速度が徐々に減速して停止する 1 分間の冷却期間を設け、合計 34 分間のレジメンを 6 日に実施します。以前に公表されたとおり、15 週間にわたって週に 1 日。 15 日間の順応は、11.5 m/分の速度で 3 分間開始し、1 セッションあたり 30 分の目標継続時間に達するまで、1 日あたり 2 分ずつ継続時間を増やしました。 HSALR マウスは生後 14 か月で順応手順を開始し、生後 17.5 ～ 18 か月で訓練計画を完了しました。

CUGexp RNA 焦点を特定するために、以前に公開されたプロトコルの修正を使用しました 25,58。 8 µm の筋肉凍結切片を 3% パラホルムアルデヒド、pH 7.3 の 1X PBS 溶液で固定し、1X PBS で洗浄し、1X PBS 中の 0.5% Triton X-100 を 5 分間使用するか、1X PBS 中の 0.2% Triton X-100 を使用して核を透過処理しました。 ＰＢＳで室温で１０分間インキュベートし、プレハイブリダイゼーション溶液（３０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ）中で室温で１０分間インキュベートした。 ハイブリダイゼーションは、33% ホルムアミド、2× SSC、0.2 mg/ml ウシ血清アルブミン (NEB 製品番号 B9001S)、70 μg/ml 酵母 t-RNA (Invitrogen 製品番号 15401-011)、2 中で 37 °C で 3 時間行いました。 mM リボヌクレオシド バナジル複合体 (NEB 製品番号 S1402S)、および Alexa647 で 5' 標識された 1 μg/ml 2'-O-メチル修飾 RNA CAG リピート プローブ。 ハイブリダイゼーション後、切片を 30% ホルムアミド/2X SSC 中で 42 °C で 30 分間インキュベートし、続いて 1X SSC で室温で 30 分間インキュベートし、室温で 1X PBS で 3 回洗浄した後、一次抗体による標識に進みました。

5'-Alexa647-mCmAmGmCmAmGmCmAmGmCmAmGmCmAmGmCmAmGmCmA-3'

(HPLC精製;「m」はRNA塩基に2'-O-メチル修飾があることを示します;IDT)。

FISH 後に MBNL1 および MBNL2 タンパク質の局在を特定するために、筋肉切片を抗 MBNL1 ウサギ ポリクローナル抗体 (PBS 中 2 μg/ml、アブカム製品番号 ab45899) と抗 MBNL2 (3B4) マウス モノクローナル抗体 (アイソタイプ IgG2b、4 μg) 中でインキュベートしました。 /ml PBS;Santa Cruz Biotechnology, Inc. 製品番号 sc-136167) 4 °C で一晩、続いてヤギ抗ウサギ Alexa 488 (Invitrogen 製品番号 A-11034) およびヤギ抗マウス IgG2b Alexa 546 (Invitrogen 製品番号 A) -21143) 二次抗体 (各 1 μg/ml PBS) を室温で 1 時間反応させます。 FISH 後、一部の切片は抗 MBNL2 一次抗体および二次抗体のみで標識されました。 筋線維と核を強調するために、FITC 標識小麦胚芽凝集素 (10 μg/ml、Sigma 製品番号 L4895) および DAPI (33 ng/ml) を二次抗体とともに添加しました。

ミオシン線維タイプを決定するために、未固定の 8 µm 凍結筋肉切片を 10% 正常ヤギ血清を含む PBS で室温でブロックし、その後マウスモノクローナル一次抗体 BA-F8 (アイソタイプ IgG2b、ミオシン重鎖タイプ 1) でインキュベートしました。 SC-71 (アイソタイプ IgG1、ミオシン重鎖 タイプ 2 A)、および BF-F3 (アイソタイプ IgM、ミオシン重鎖 タイプ 2B)、それぞれ 5 µg/ml PBS で室温で 1 時間 (Developmental Studies Hybridoma Bank, University)アイオワ州; すべてパドバ大学 S. Schiaffino によって寄託されました。 ミオシン重鎖タイプ 2X を発現する線維は標識されないまま (黒色) であるか、2A 線維または 2B 線維の 50% 未満の強度を示しました。 また、マウスモノクローナル抗体 6H1 (アイソタイプ IgM) を 5 μg/ml PBS で使用して 2X ファイバーを同定しました (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa; C. Lucas, University of Sydney 寄託)。 二次抗体は、Alexa647 ヤギ抗マウス IgG2b (Invitrogen 製品番号 A-21242)、Alexa 488 ヤギ抗マウス IgG1 (Invitrogen 製品番号 A-21121)、および Alexa 546 ヤギ抗マウス IgM (Invitrogen 製品番号 A-21045) でした。 、すべて 2 μg/ml PBS で室温で 1 時間。 ClC-1 タンパク質の局在を特定するために、未固定の 8 µm 凍結切片を PBS 中の 10% 正常ヤギ血清でブロックし、アフィニティー精製した抗ラット CLC-1 IgG ウサギ ポリクローナル抗体 (PBS 中 20 µg/ml、Alpha Diagnostic International 製品) で標識しました。番号CLC11-A）を抗MyHC 2A（SC-71）および抗MyHC 2B（BF-F3）抗体（上記参照）とともに4℃で一晩反応させた。 二次抗体はヤギ抗ウサギ Alexa647 (1 μg/ml、Invitrogen 製品番号 A-21244) でした。 前述のように、退色防止媒体 (Prolong Gold、Invitrogen 製品番号 P36930) および No. 1 1/2 カバー ガラス (Zeiss 製品番号 474030-9000-000) を使用してすべてのスライドをマウントしました 30。

単一画像または Z シリーズ スタックをキャプチャするには、AxioImager 顕微鏡 (Zeiss)、DAPI 用フィルター (励起/発光 365/445、Zeiss フィルター セット 49)、GFP (励起/発光 470/525、Zeiss フィルター セット 38) を使用しました。 、Cy3 (励起/発光 550/605; Zeiss フィルター セット 43 HE)、および Cy5 (励起/発光 640/690; Zeiss フィルター セット 50)、Flash 4.0 LT sCMOS カメラ (浜松)、および Volocity 画像取得ソフトウェア (バージョン 6.3) .1; パーキン・エルマー）。 目標は、×5 EC Plan-NEOFLUAR NA 0.16、×10 EC Plan-NEOFLUAR NA 0.3、×20 Plan-APOCHROMAT NA 0.8、×40 Plan-APOCHROMAT NA 1.4、および×63 Plan-APOCHROMAT NA 1.4 でした。 蛍光を定量するために、前述したように、Volocity 定量および復元ソフトウェア モジュール (バージョン 6.3.1; Perkin Elmer) を使用しました 30。 Clcn1 ASO または逆オリゴで処理した LR41;Mbnl1-/- マウスの TA 筋線維の 8 μm 凍結切片において、平行接線間の最小距離として定義される最小フェレ径 37 を MyHC 線維タイプ別に測定しました。 未処理の WT を対照として使用しました。

我々は、拡張された CUG リピート領域の 3' 側にある ACTA1 転写物を標的とする 20 mer RNase H 活性ギャップマーである ASO 445236 を使用しました 38。 中央のギャップセグメントは、5 つの 2'-O-メトキシエチル修飾ヌクレオチドが 5' および 3' ウイングに隣接する 10 個の 2'-デオキシリボヌクレオチド (以下の下線) から構成されます。 ヌクレオチド間結合はホスホロチオエートであり、すべてのシトシン残基は 5'-メチルシトシンです。 我々は、25 mg/kgの用量でマウスを週2回、4週間皮下注射（8回投与）し、さらに4週間に1回（追加の2回投与で合計10回）でマウスを治療した。

Gapmer ASO 445236 配列: 5'-CCATTTTCTTTCCACAGGGCT-3' (以前に公開された 38)。

Clcn1 選択的スプライシングを修正するために、以前に記載されているように、前脛骨筋 (TA) の筋肉内注射によって Clcn1 エクソン 7a の組み込みを抑制するように設計されたモルフォリノ ASO を投与しました 24。 対側の TA は、活性アンチセンス薬の 5' から 3' への反転を受けました。 Clcn1 を標的とする ASO とインバート コントロール オリゴの両方を Gene Tools, LLC から購入しました。 投与量はそれぞれ20μgであった。 アンチセンスモルホリノの分布を強化するために、オリゴ注射の2時間前に0.4 U/Lヒアルロニダーゼを注射することによってTA筋肉を前処理しました。 標的組織へのオリゴの細胞内取り込みを促進するために、100 V/cm、パルス持続時間20ミリ秒、周波数10 Hz、筋肉あたり合計10パルスの設定を使用して、IM注射直後に筋肉にエレクトロポレーションを行いました。

Clcn1-7a アンチセンス配列: 5'-CCAGGCACGGTctgcaacagagaag-3' (大文字はエクソン標的配列、小文字はイントロン標的配列を示します)

Clcn1-7a 逆方向配列: 5'-gaagagacaacgtctggcacggacc-3' (ノンターゲティング コントロール)

これらのオリゴはどちらも以前に公開されています24。

メーカーの推奨に従って、筋肉組織を Trizol (Life Technologies) でホモジナイズし、ブロモクロロプロパンを使用して DNA とタンパク質を除去し、イソプロパノールで RNA を沈殿させ、ペレットを 75% エタノールで洗浄し、ペレットを分子グレードの水に溶解しました。 RNA の濃度と品質を決定するために、以前に記載されているように、A260 および A280 値 (Nanodrop) を測定し、アガロースゲル電気泳動によって 18 S および 28 S リボソーム RNA バンドを検査しました 30。

Superscript III逆転写酵素（Life Technologies）およびランダムプライマーを使用してcDNAを作成し、Amplitaq Gold（Life Technologies）および遺伝子特異的プライマーを使用してPCRを実行しました。 アガロースゲルを使用して PCR 産物を分離し、1× SYBR I グリーン核酸ゲル染色 (Life Technologies 製品番号 S7567)/1× TBE で DNA を 1 時間標識し、トランスイルミネーター、CCD カメラ、XcitaBlueTM 変換スクリーンを使用してバンド強度を定量しました。および、前述したとおり、Image Lab 画像取得および分析ソフトウェア (Image Lab バージョン 5.2.1; Bio-Rad)。 Atp2a1、Clcn1、Clasp1、およびTitinの選択的スプライシングを標的とするプライマーの配列を補足表2に示します。

Clcn1 エクソン 7a の選択的スプライシングを定量するために、Primer3 ソフトウェア 60,61 を使用して、エクソン 7a – エクソン 7 スプライス部位を標的とする Fam 標識アッセイと、エクソン 6 – エクソン 7 スプライス部位を標的とする別の Hex 標識アッセイを設計しました。 プローブには ddPCR Supermix (Bio-Rad 製品番号 186-3010)、自動液滴生成器 (Bio-Rad QX200)、自動液滴リーダー (Bio-Rad QX200)、およびメーカーの指示に従って PCR サイクル条件を使用しました (前述のとおり)。 。 ミオシン重鎖遺伝子発現の ddPCR 定量化には、Myh2 (タイプ 2 A; Bio-Rad 独自のアッセイ ID qMmuCEP0055637; アンプリコン長 88 bp)、Myh1 (タイプ 2X; Bio-Rad 独自) に対して市販の Fam 標識プライマー プローブ アッセイを使用しました。アッセイ ID qMmuCIP0033700; アンプリコン長 113 bp）、Myh4（タイプ 2B; Bio-Rad 独自のアッセイ ID qMmuCEP0058927; アンプリコン長 74 bp）、および Myh3（発生ミオシン; Bio-Rad 独自のアッセイ ID qMmuCIP0034632; アンプリコン長 186 bp）。 ACTA1 導入遺伝子の発現レベルを測定するために、エクソン 1 – エクソン 2 スプライス部位 6 を標的とするヒト ACTA1 mRNA およびイントロン 1 – エクソン 2 スプライス部位を標的とするヒト ACTA1 プレ mRNA に対する以前に公開された Fam 標識アッセイを使用しました 25。 マウス Dmpk の測定に使用した Fam 標識アッセイは、以前に発表されました 38。 正規化コントロールとして、マウス Acta1 の市販の標準アッセイ (Hex 標識プローブ、Bio-Rad 独自のアッセイ ID qMmuCEP0027908、アンプリコン長 117 bp) を使用しました。 PCR が完了した後、プレートをドロップレット リーダーにロードし、QuantaSoft ソフトウェア (バージョン 1.7.4; Bio-Rad) を使用して処理および分析し、個々のサンプルからの 20 マイクロリットルの二重アッセイのマイクロリットルあたりの平均コピー数を使用して総イベントを定量しました。 、前述したように59。 すべてのカスタム設計のプライマーおよびプローブの配列を補足表 3 に示します。

LR41;Mbnl1-/- マウスにおける Clcn1 ASO 治療に対する反応は不明でした。 したがって、薬力学的活性を測定するための十分な検出力を確保するために、事前にサンプルサイズを選択することができませんでした。 代わりに、我々は以前の研究における Clcn1 ASO エクソンスキッピング パターンの RT-PCR 分析に基づいてサンプル サイズを推定しました 24。 マウスは生後 7 週間から 18 か月の範囲で、遺伝子型によってランダムに選択され、雌と雄の数がほぼ同数になるように性別によって階層化されました。 1 人または 2 人の検査官が ASO 研究の治療割り当てについて盲検であったにもかかわらず、スプライシング解析と MyHC 画像定量化データは非常に堅牢であったため、盲検化を解除する前に Clcn1 ASO 治療グループからインバート コントロール オリゴ治療グループを効果的に識別できました。 LR41;Mbnl1-/- と LR41 の間の表現型の明らかな違いにより、活性モニタリング研究を盲検化することは不可能でした。 実験結果の再現性を検証するために、全体で 3 つの DM1 マウス モデル、ASO 実験用に 2 つの DM1 マウス モデル、2 つの時点、および Clcn1 選択的スプライシング パターンを定量化する 2 つの方法を使用しました。

2 グループおよび複数グループの比較には、対応のない両側 t 検定または分散分析 (ANOVA) をそれぞれ使用しました (Prism ソフトウェア バージョン 9.4.1; GraphPad, Inc.)。 グループデータは平均値±標準誤差として表示されます。P値<0.05は有意であると考えられました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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博士たちに感謝します。 研究で使用した ACTA1 を標的とする ASO の提供については F. Rigo および CF Bennett、支援には Elaine and Richard Slye Fund (TMW) および筋ジストロフィー協会 (賞 ID 234905; TMW) に感謝します。

米国マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院およびハーバード大学医学部神経科

Ningyan Hu、Eunjoo Kim、Layal Antoury、サーマン M. ウィーラー

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NH、EK、LA、TMW は実験を実施し、データを分析しました。 TMW は研究を設計し、論文を執筆しました。

サーマン・M・ウィーラーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Hu、N.、Kim、E.、Antoury、L. 他。 Clcn1 選択的スプライシングを修正すると、筋強直性ジストロフィーマウスの筋線維タイプの移行が逆転します。 ナットコミューン 14、1956 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37619-1

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受信日: 2022 年 9 月 4 日

受理日: 2023 年 3 月 21 日

公開日: 2023 年 4 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37619-1

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