前脳基底部の活性化

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22044 (2022) この記事を引用

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環境の手がかりや気分、報酬、嫌悪感などの内部状態は、ホメオスタシスの必要性を超えて摂食行動に直接影響します。視床下部は、摂食の恒常性における役割について広く研究されています。しかし、原子価と感覚信号（味や匂いなど）を統合する、より複雑で非恒常性の摂食を駆動する神経回路の多くは依然として不明です。ここでは、非恒常性摂食行動を直接調節する前脳基底核 (BF) から側手綱核 (LHb) への回路について説明します。ウイルス媒介回路マッピングを使用して、嫌悪感や食物関連の匂いを含む多様な感覚信号に反応する、LHb に投射する BF 内のグルタミン酸作動性ニューロンの集団を特定しました。 BF-to-LHb 回路の光遺伝学的活性化は、強力な反射的な嫌悪感を引き起こします。さらに、この回路が活性化すると、絶食状態での食事への衝動が抑制されます。これらのデータを総合すると、環境の合図を感知することによって、LHbに関連する嫌悪感や摂食行動を調節する前脳基底部グルタミン酸作動性ニューロンの役割が明らかになった。

摂食は、すべての動物の生存に不可欠な食欲行動です。ホメオスタシス給餌、つまりカロリー要件を満たすための給餌は、適切な体重と代謝の健康を維持するために、カロリー出力とカロリー摂取のバランスを取ることで構成されます。ただし、これは摂食行動の 1 つの要素にすぎません。環境の手がかり（味や匂いなど）、気分、報酬、嫌悪感はすべて摂食に影響を与え、通常の健康的なカロリー要件を超えたり下回ったりする可能性があります1、2、3。恒常性摂食とは対照的に、これらの非恒常性摂食メカニズムは、食料源が信頼できない可能性がある変化する環境に生物を適応させるために進化しました。しかし、食物が簡単に手に入るようになると、これらのメカニズムが適応できなくなる可能性があります。

非恒常性摂食の典型的な例は、動物が必要なカロリーを超えて食物を摂取するように仕向ける、報酬に基づく快楽的な行動です。逆に、食べ物に対する嫌悪感や脅迫的な刺激により、絶食状態であっても食べ物の摂取が妨げられる場合があります。たとえば、腐った食べ物や近くの捕食者を示す合図は、それぞれ生存を確保するために優先的な回避行動や逃避行動を引き起こす可能性があります。視床下部が恒常性摂食の重要な側面を調節しており4、5、6、7、8、恒常性、報酬、嫌悪経路が収束して摂食を制御している9、10、11ことは一般に理解されていますが、その回路、神経構成要素、およびパターンは非恒常性摂食行動を媒介する機能的接続性は、依然としてほとんど知られていない。

私たちと他の研究者は、最近、前脳基底部が非恒常性摂食に直接影響を与える回路ノードであることを特定しました 12,13,14。注目すべきことに、BFの興奮性グルタミン酸作動性ニューロンが遺伝的に慢性活性化の標的にされた場合、マウスは重度の致死的食欲低下を示した。この摂食抑制には、食物および食物関連の刺激に対する嫌悪感が伴っていました。視床下部外側領域 (LHA) へのグルタミン酸作動性 BF の投射は、観察された嚥下と嫌悪の両方の原因の一部として同定されましたが、LHA 内のグルタミン酸作動性 BF 末端の直接活性化は、BF 細胞体の活性化によって示される食物に関連する嫌悪を完全に表現模写しませんでした。、これは、BF の他の下流ターゲットが、観察された食品関連の嫌悪感に寄与していることを示唆しています 12。

ウイルス媒介の順行性投影マッピングを通じて、BF のグルタミン酸作動性ニューロンが脳内の顕著な嫌悪中枢である外側手綱核 (LHb) にも投影しており、LHb が BF から感覚情報を受け取っていることがわかりました。さらに、BF から LHb への投影が活性化されると、この回路は記憶を妨害する強力な反射のような嫌悪感を引き起こします。この回路は、食欲に影響を与えることなく、恒常的に食べるという衝動を抑制します。これらのデータを総合すると、恒常性状態とは無関係に摂食を直接調節するためにグルタミン酸作動性前脳基底部と LHb を結び付ける脳回路が特定される。

vGlut2BF ニューロンが回避/嫌悪回路を介して摂食停止をどのように駆動するかを調べるために、我々はまず、嫌悪行動に関与する下流のエフェクター標的を特定しようとしました。これに向けて、vGlut2-Cre+/- マウスの大脳基底前脳に Cre 依存性シナプトフィジン::mRuby2 アデノ随伴ウイルス (rAAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2) を定位的に注入することで順行性投影マッピングを実行し、識別を可能にしました。シナプス前BF末端とその推定下流ターゲットの数（図1a、b）。我々は、以前に調査した視床下部外側領域（LHA）を含む、既知のグルタミン酸作動性BF入力を有する以前に記載された領域で多数の末端を観察した（図1c、補足図112）。注目すべきことに、外側手綱核（LHb）はBF投影によって強力に神経支配されていました（図1d）。側手綱核が嫌悪行動を引き起こすことが知られている3,15ことを考慮して、嫌悪と摂食抑制を媒介する候補回路としてvGlut2BF-to-LHb（vGlut2BF→LHb）接続性を調査した。

グルタミン酸作動性 BF ニューロンは LHb を強力に神経支配し、グルタミン酸作動性 LHb ニューロンと機能的に接続されています。 (a) vGlut2BF 細胞からの順行性トレースの実験セットアップ。 (b) 前脳基底部への Cre 依存性シナプトフィジン::mRuby2 の代表的なウイルス標的化 (BF、ブレグマ 0.62)。スケールバー = 300 μm。 (c) グルタミン酸作動性 BF 入力を受けるさまざまな脳領域の定量化。定量化は、Syn::mRuby2+ 端子の密度/ROI の体積として計算されます。 PC、梨状皮質。 LHb、外側手綱核。 LHA、視床下部外側領域。 VMH、視床下部腹内側。 DMH、視床下部背内側。 VTA、腹側被蓋野。 PAG、水道周囲灰色。 PMN、前乳頭核。 IPR、脚間核。（ d ）外側手綱核（LHb）のシナプトフィジン::mRuby2投影端末（ブレグマ−1.82）。 ii) 拡大された挿入図。 MHb、内側手綱核。（ e ）LHbのmRuby + / vGlut2 +細胞から記録しながらvGlut2 + BF端末を刺激する、チャネルロドプシン支援回路マッピング実験の実験セットアップ。 (f) LHb で終わる vGlut2BF ニューロンからの ChR2-EYFP 線維。 LHb 内の mRuby+ vGlut2LHb 細胞は、ChR2 を発現する BF 投影と重複します。 (g) LHb 内の mRuby+ 細胞からの代表的な ex vivo 電気生理学的トレース。 CSF、脳脊髄液（コントロール）。 TTX (1 μM)、4-AP (0.5 μM)、および CNQX/AP5 (10 μM/50 μM) を順次添加しました。（h）（1）aCSF（−320.20±71.30pA）、（2）+TTX（−44.20±19.20pA）、（3）+4AP（ − 243.10 ± 47.08 pA) および (4) + CNQX/AP5 (− 20.43 ± 4.64 pA)。エラーバーは SEM を表します。すべてのグループをaCSF対照グループと比較する一元配置分散分析を使用して統計的に比較しました。 aCSF 対 TTX: p = 0.0010、aCSF 対 + 4AP: p = 0.5496、aCSF 対 + CNQX/AP5: p = 0.0013。 aCSF の場合は n = 12、TTX の場合は n = 10、4AP の場合は n = 11、CNQX/AP5 の場合は n = 7。 (i) TTX と 4AP の両方を添加した、aCSF 内の mRuby+ LHb 細胞の平均振幅。エラーバーは SEM を表します。それぞれ n = 12 と 11。 aCSF = − 320.20 ± 71.30 pA、+ TTX/4AP = − 243.10 ± 47.08 pA。対応のない t 検定を使用して統計的に比較した場合、p = 0.3859。 (j) BF 端子の光刺激時の mRuby+ LHb セルの最大電流の 10% までの平均待ち時間 (5.940 ± 0.04 ミリ秒)。エラーバーは SEM を表します。 n = 15。

解剖学的追跡データを裏付けるために、次に前脳基底部と外側手綱核が機能的に接続されているかどうかをテストしました。以前の研究では、LHb には主に vGlut2+ 細胞が含まれていることが示されていたため 16、Cre 依存性チャネルロドプシン (ChR2) を発現する AAV を BF (rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA) と Cre 依存性チャネルロドプシン (ChR2) を発現する AAV を注入しました。 vGlut2-Cre+/-動物のLHb（rAAV-Ef1α-flex-mRuby2）へのmRuby2レポーターウイルス（図1e、f）。次に、LHb に投射する vGlut2BF ニューロンを選択的に光刺激し、LHb 内の mRuby+ vGlut2+ 細胞から視覚的に誘導された全細胞記録を作成しました。記録されたLHb標的ニューロンでは、平均振幅-320.20±71.30pAのvGlut2BF光刺激による強力な脱分極が観察されました（図1g–i）。さらに、473 nmの光パルスの終わりから10％最大電流までの平均待ち時間は5.94±0.039ミリ秒であり、単シナプス接続を示唆しています（図1j）。さらに、TTXおよび4-APの存在下で記録を実行すると、vGlut2BF→LHb接続が単シナプスであることが示されました（図1g–i）。この応答は、AMPAおよびNMDA受容体アンタゴニストであるCNQXおよびAPVの存在下では消失し、グルタミン酸作動性応答を示しています（図1g、h）。まとめると、これらのデータは、vGlut2LHb 細胞が vGlut2BF ニューロンから強力な神経支配を受けていること、およびこれらのノードが単シナプス的に接続されていることを示しています。

vGlut2BF ニューロンは、摂食抑制と嫌悪を引き起こすことに加えて、嫌悪や食物関連の嗅覚刺激などの多様な感覚刺激にも反応します 12,17,18。 BF と LHb が機能的に接続されているとすると、次に、LHb への BF 投影が感覚情報に応答するか、または LHb 自体内のニューロンが反応するかを判定しようとしました。揮発性臭気物質の豊富さと多様性、およびマウスにとって特定の臭気は生来的に嫌悪感を示す、食欲を示す、または報酬を与えることが知られている 19,20,21 ため、我々は LHb 内の vGlut2BF 軸索終末の神経活動を記録しながら嗅覚刺激を提示しました。このために、vGlut2BF ニューロンに対する Cre 依存性 GCaMP8 (rAAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s) の発現を標的にし、食欲をそそる食物関連 19,20 または生来の嫌悪臭 (キツネの尿、腐った食べ物) のいずれかを提示しながら、LHb でファイバー測光を実行しました。前述の連続フロー嗅覚計を使用して、臭気および微量アミン19,21)を測定しました（図2a、b、補足図2a22）。臭気物質は、ランダム化された順序で 10 回反復して、それぞれ 2 秒間提示され、臭気提示間の間隔は 18 秒でした。

グルタミン酸作動性の BF から LHb への投射と BF 入力を受ける LHb 細胞は、嫌悪感および食物関連の感覚刺激に反応します。 (a) ファイバー測光記録用の実験セットアップ。（ b ）LHbのvGlut2BF軸索末端を記録するための実験セットアップと光ファイバーターゲティングの代表画像（ブレグマ-1.58）。（ c ）生物学的複製（ n = 12）にわたるvGlut2BF→LHb軸索末端（黒）の平均zスコアdF / Fトレース。灰色の輪郭は 95% CI を表します。ピンクのボックスは 2 秒間の臭気配信を表します。ヒートマップは、12 匹のマウスすべてにおける特定の匂いの各提示 (匂いごとに 10 回の反復) を示します。黄色 = 1 (最大アクティビティ)、濃い青 = 0 (最小アクティビティ)。 MATLAB によって生成されたヒートマップ (バージョン R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html)。 (d) ファイバー測光法を使用して記録された BF ターミナルの平均臭気反応。エラーバーは SEM を表します。 n = 12。平均 Z スコア dF/F 臭気反応: 鉱物油 = 0.19 ± 0.22 (p = 0.41)、キツネの尿 = 0.74 ± 0.22 (p = 0.0070)、固形飼料 = 0.79 ± 0.35 (p = 0.048)、メチルブチルアミン= 0.80 ± 0.36 (p = 0.047)、カダベリン = 0.73 ± 0.23 (p = 0.0087)、酪酸 = 0.84 ± 0.28 (p = 0.013)。（ e ）ファイバー測光法を使用して記録されたBFターミナルの平均臭気反応曲線下面積（AUC）。エラーバーは SEM を表します。 n = 12。z スコア dF/F 臭気反応の平均 AUC: 鉱物油 = 78.61 ± 80.24 (p = 0.35)、キツネの尿 = 273.0 ± 82.50 (p = 0.0070)、固形飼料 = 289.1 ± 131.1 (p = 0.049) 、メチルブチルアミン = 302.0 ± 127.6 (p = 0.037)、カダベリン = 256.9 ± 85.95 (p = 0.012)、酪酸 = 312.7 ± 103.5 (p = 0.012)。（ f ）AAV1-Creを使用したBF入力を受けたLHb細胞のファイバー測光記録の実験セットアップと光ファイバーターゲティングの代表画像（ブレグマ-1.58）。（ g ）生物学的複製（n = 6）にわたるBF入力（黒）を受けたLHb細胞の平均zスコアdF / Fトレース。灰色の輪郭は 95% CI を表します。ピンクのボックスは 2 秒間の臭気配信を表します。ヒートマップは、6 匹のマウスすべてにわたる特定の匂いの各提示 (10 回の反復) を示します。黄色 = 1 (最大アクティビティ)、濃い青 = 0 (最小アクティビティ)。 MATLAB によって生成されたヒートマップ (バージョン R2019a; https://www.mathworks.com/products/matlab.html)。 (h) ファイバー測光法を使用して記録された、BF 入力を受けた LHb 細胞の平均臭気反応。エラーバーは SEM を表します。 n = 6。平均 Z スコア dF/F 臭気反応: 鉱物油: − 0.14 ± 0.34 (p = 0.69)、キツネの尿 = 0.85 ± 0.29 (p = 0.033)、チョウ = 1.83 ± 0.10 (p = < 0.0001) 、メチルブチルアミン = 1.78 ± 0.18 (p = 0.0002)、カダベリン = 1.66 ± 0.21 (p = 0.0006)、酪酸 = 1.54 ± 0.24 (p = 0.0013)。 (i) ファイバー測光法を使用して記録された、BF 入力を受ける LHb 細胞の平均臭気反応曲線下面積 (AUC)。エラーバーは SEM を表します。 n = 6。z スコア dF/F 臭気応答の平均 AUC: 鉱物油 = − 51.10 ± 123.3 (p = 0.70)、キツネの尿 = 306.0 ± 103.0 (p = 0.031)、チョウ = 680.9 ± 37.48 (p = < 0.0001)、メチルブチルアミン = 652.9 ± 66.78 (p = 0.0002)、カダベリン = 604.0 ± 76.99 (p = 0.0005)、酪酸 = 553.7 ± 95.45 (p = 0.0021)。

匂いを送達すると、vGlut2BF→LHb末端は嫌悪臭と食品関連の匂いの両方に反応しましたが、鉱油対照には反応しませんでした（図2c）。平均臭気反応と平均曲線下面積（AUC）の両方を含む測光記録の定量化により、vGlut2BF→LHbニューロンが食物臭と生来の嫌悪臭の両方によって同様のレベルで活性化されることが明らかになりました（図2d、e、補足図3）。）。たとえば、平均臭気応答のベースライン減算 Z スコア値を比較すると、vGlut2BF→LHb 末端では微量アミンのメチルブチルアミンに対して 0.80 ± 0.36 (p = 0.047) 蛍光の増加が示され、微量アミンのメチルブチルアミンに対しては 0.79 ± 0.35 (p = 0.048) 蛍光の増加が見られました。固形飼料の臭気物質 (図 2d)。 LHb への VGlut2BF 投射は、中性臭気に反応する可能性が低く、食欲をそそる口当たりの良い食物臭物質であるピーナッツバターには反応しませんでした (補足図 4)。したがって、LHb への vGlut2BF の投影は、嫌悪感と食欲の両方の感覚情報に反応すると思われます。 vGlut2BF→LHb 末端の幅広い反応を考慮して、次に、LHb のニューロンがどの程度この感覚情報を受け取り、直接反応するかを疑問に思いました。これに向けて、我々は、順行性シナプス伝達型 Cre (rAAV1-hSyn-Cre)23 を野生型動物 (C57BL/6NJ) の BF に定位的に標的化し、同時に Cre 依存性 GCaMP8 (rAAV-Synapsin-flex-) を LHb に注入および移植しました。 jGCaMP8s）および測光記録用の光ファイバーインプラント（図2f、補足図2b）。これにより、BF シナプス入力を受け取る LHb 標的細胞から記録することが可能になりました。 vGlut2BF末端の測光応答から観察したことと一致して、LHbニューロンの嫌悪臭と食物関連の臭気の両方に対する強力な臭気反応に注目しました（図2g–i、補足図5）。たとえば、平均臭気応答のベースラインを差し引いた Z スコア値を比較すると、BF で AAV1-Cre によって標的化された LHb 細胞は、微量アミンのメチルブチルアミンに対して 1.78 ± 0.18 (p = 0.0002)、および 1.83 ± 0.10 (p = 0.0002) 蛍光の増加を示しました。 p = < 0.0001）を食事の臭気物質に換算します（図2h）。 BF入力を受けたLHb細胞は、いくつかの中性臭気および食欲をそそる口当たりの良い食べ物の匂いであるピーナッツバターにも反応するようでした（補足図6）。したがって、vGlut2BF→LHb の投影は、LHb への食欲/食物関連および嫌悪性の合図の両方を含む幅広い感覚情報を中継し、LHb は多様な嗅覚刺激にも反応します。

我々は、グルタミン酸作動性BFが食物摂取の抑制と嫌悪感の促進における主要なノードであることを特定し、vGlut2BFニューロンが強力な投射をLHbに送信することを示した。したがって、我々は、vGlut2BF→LHb接続が摂食を調節するかどうかを判断しようとしました。これに向けて、Cre依存性チャネルロドプシン2-EYFPを発現するAAV（rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP）24、または対照としてCre依存性GFP（rAAV-EF1α-flex-GFP）を定位的に標的とした。 vGlut2-Cre+/-動物のBF。膜結合型であるChR2-EYFPは、シナプトフィジン::mRuby2標識と同様の方法でBF→LHb投影を強力に標識しました（図1d）。しかし、ChR2が膜局在性であることを考慮すると、BFからLHbへの通過線維も視床を通過して視覚化されました。光ファイバーをLHb上に埋め込み、LHb内のChR2発現vGlut2BF末端を選択的に刺激した(図3a、b、補足図7)。

側手綱核突出グルタミン酸作動性前脳基底ニューロンの活性化により、食物摂取量が減少し、嫌悪感が引き起こされます。 (a) LHb の vGlut2BF 端末が活性化される、生体内光遺伝学的挙動の実験セットアップ。 (b) LHb の BF 末端をターゲットにした光ファイバーインプラントを示す代表的な画像。ブレグマ-1.46で撮影された画像。 ii) 拡大された挿入図。（ c ）vGlut2BF→LHb細胞の光遺伝学的刺激を伴う場合と伴わない場合の再給餌アッセイの実験タイムライン。 20分間の再給餌実験の期間中、5分間の刺激/非刺激間隔で測定した固形飼料の平均摂食量(g)。実線の記号は平均値を表し、中空/透明の記号は生物学的複製の個々の値を表します。統計的有意性は、多重比較のための Sidak 補正を使用した反復測定二元配置分散分析を使用して計算されます。エラーバーは SEM を表します。 n = 7。5 分の刺激時間: GFP コントロール = 0.12 ± 0.021 g、ChR2 動物 = 0.05 ± 0.019 g、p = 0.0078。 10 分間の非刺激時間: GFP コントロール = 0.07 ± 0.008 g、ChR2 = 0.100 ± 0.018 g、p = 0.6608。 15 分の刺激時間: GFP コントロール = 0.07 ± 0.016 g、CHR2 = 0.03 ± 0.008 g、p = 0.2345。 20 分間の非刺激時間: GFP コントロール = 0.06 ± 0.013 g、ChR2 = 0.097 ± 0.020 g、p = 0.3297。 (d) 光遺伝学的刺激を用いたリアルタイムの場所回避アッセイのための実験セットアップ。（ e ）マウスがチャンバーの右側で刺激されたリアルタイム場所回避アッセイ中の、代表的なGFPコントロールマウスとChR2-EYFPマウスの動きを示すヒートマップ。ヒートマップは、Noldus Noldus EthoVision (XT 16; https://www.noldus.com/ethovision-xt) ソフトウェアを使用して生成されました。（ f ）GFP対照およびChR2-EYFP発現動物が20分間の実験中にアリーナの非刺激側または刺激側で過ごした平均時間の割合。統計的有意性は、ボンフェローニ補正による比例の二項検定を使用して決定されます。帰無仮説 = 50%。エラーバーは SEM を表します。 n = 7。GFP コントロールの場合、時間の 47.68 ± 1.98% を非刺激側に費やし、51.32 ± 1.97% を刺激側に費やしました (p = 0.7644)。 ChR2 の場合: 非刺激側で 71.07 ± 4.70% 時間、刺激側で 27.84 ± 4.82%、p < 0.0001。 (g) チャンバーの刺激側への各訪問の平均継続時間。統計的有意性は、対応のない両側 t 検定を使用して決定されます。 GFP コントロール = 17.50 ± 3.98 秒、ChR2 = 7.71 ± 1.79 秒、p = 0.0447。 n = 7。(h) 刺激ゾーンへの訪問回数。統計的有意性は、対応のない両側 t 検定を使用して決定されます。 GFP コントロール = 42.00 ± 5.52 来院、ChR2 = 56.29 ± 9.05 来院、p = 0.2026 (有意差なし)。 n = 7。

摂食行動に対する vGlut2BF→LHb 活性化の影響をテストするために、マウスを一晩絶食させた後、20 Hz の 470 nm 光 (vGlut2BF ニューロン 25 の最大発火速度) で 5 ms パルスで 5 分間刺激し、その後 5 分間オフ期間を設けました。食べ物を与えられている間。摂食量は 5 分ごとに合計 20 分間測定されました (図 3c)。 ChR2発現マウスは、光刺激期間中に食物摂取量を約50％大幅に減少させましたが、光刺激のない期間には対照動物と同じ量の食物を消費しました（図3c; ChR2-EYFPマウスは0.05±0.02gの餌を摂取しましたが、GFPコントロールは摂取しました）最初の刺激試合では 0.12 ± 0.02 g (p = 0.0078))。したがって、vGlut2BF→LHb末端の選択的活性化は、絶食動物における食物摂取を一時的かつ有意に妨げたが、光刺激を停止するとすぐに、通常の衰えることのない摂食行動が再開した。

グルタミン酸作動性 BF は嫌悪感を媒介することが示されている 12,26 ため、次に、vGlut2BF→LHb 末端の光遺伝学的活性化が嫌悪行動を媒介するかどうかを尋ねました。これをテストするために、LHbを移植した光遺伝マウス（図3a、b）をリアルタイムの場所回避アッセイに供し、マークのないアリーナの半分でマウスに光刺激（20 Hz、5 msのパルス）を与えました（図3a、b）。 3d）。マウスはビデオ録画され、アリーナのどちらかの半分で費やされた時間が事後分析されました。 GFP 発現対照マウスは、チャンバーの両側で等しい時間を費やしました (刺激側で 51.32 ± 1.97%、非刺激側で 47.68 ± 1.98%、p = 0.7644)。しかし、ChR2発現マウスは、vGlut2BF→LHb回路の光刺激用にプログラムされた領域に対して明らかな嫌悪感を示し、非刺激側と比較して刺激側で過ごす時間が大幅に短かった(刺激側で27.84±4.82%、刺激側で71.1±1%)。非刺激側で 4.7%、p = < 0.0001;図 3e、f)。さらに、刺激側への平均訪問時間は、GFPコントロールと比較してChR2マウスの方が有意に短かった（ChR2-EYFPマウスの場合は7.71±1.79秒、GFPコントロールの場合は17.5±3.98秒、p = 0.0447;図3g）。しかし、GFPコントロールとChR2-EYFPマウスは刺激ゾーンへの訪問回数が同程度であり（図3h）、これはChR2マウスが嫌悪感を引き起こしたにもかかわらず刺激ゾーンへの侵入を続けたことを示しています。総合すると、これらの観察は、リアルタイム場所回避アッセイ中に ChR2 マウスが全体的に費やす時間が短く、刺激ゾーンへの訪問時間が短いため、vGlut2BF→LHb 回路が明白なリアルタイム場所回避を駆動していることを示唆しています。

vGlut2BF→LHb回路の活性化で観察される劇的な嫌悪表現型のため、我々は次に、この回路が連合条件付け後に学習された嫌悪反応を引き起こすかどうかを疑問視した。これをテストするために、動物が文脈マーカーを含むアリーナの半分（縞模様の壁、図4a）にいるときにvGlut2BF→LHbニューロンを光遺伝学的に活性化し、その後、合図と光刺激によるvGlut2BFの嫌悪感を関連付ける能力を測定しました。 →LHb回路。このために、条件付けされた場所回避パラダイムを使用して、マウスを1日あたり20分間、3日間連続で訓練しました（図4a）。試験日（４日目）、動物は前日と同じチャンバーに入れられたが、光刺激は受けなかった。総活動量を 20 分間記録し、チャンバーの両側で費やした時間を事後分析しました。リアルタイムの場所回避アッセイ中に光刺激を嫌うにもかかわらず（図3d〜h）、マウスは条件付けされた場所優先訓練後の試験当日にアリーナのマークされた側を避けることを学習せず、時間の50パーセント近くを費やしました。アリーナのどちらかの半分での時間（図4b; ChR2-EYFPマウスは非ストライプ側で時間の46.43±3.96％を費やし、ストライプ/以前に刺激された側で時間の50.78±4.07％を費やしました、p = 0.6137）。 vGlut2BF→LHb光遺伝学的マウスが侵襲性ファイバーインプラントおよび/またはウイルス注射による記憶形成障害がないことを検証するためのポジティブコントロールとして、光刺激なしでフットショックを使用して文脈的恐怖条件付けを実行しました（補足図8a）。すべてのマウスは、コンディショニング後2時間と24時間の両方で、フットショックコンディショニングチャンバーでフリーズする時間の割合の大幅な増加を示しました（補足図8b）。これは、vGlut2BF→LHb光遺伝学的マウスが無傷の学習および記憶回路を持っていることを示しています。

前脳基底部から側手綱核までの回路の光遺伝学的刺激は、記憶形成を損なう。 (a) 光遺伝学的刺激を用いた状況条件付き場所選好実験パラダイム。（ b ）GFPおよびChR2-EYFP光遺伝学的動物が、試験日に光刺激なしで状況条件付けされた場所選好領域のいずれかの側で過ごした平均時間パーセント。統計的有意性は、ボンフェローニ補正による比例の二項検定を使用して決定されます。帰無仮説 = 50%。エラーバーは SEM を表します。 n = 7。GFP コントロールの場合、非刺激ゾーンで 48.66 ± 2.798%、刺激ゾーンで 48.7 ± 2.83%、p = 0.99 を費やしました。 ChR2 動物の場合、非刺激側で 46.43 ± 3.958%、刺激側で 50.78 ± 4.07%、p = 0.6137 を費やしました。 (c) 新しい物体認識実験パラダイム。このパラダイムの光刺激バージョンでは、2 つの同一の物体で 10 分間のトレーニングセッションを行った後、マウスに 10 分間光刺激 (20 Hz、5 ms パルス) を与えました。翌日、マウスは、1 つの新しい物体と 1 つの見慣れた物体をどの程度区別できるかテストされました。 (d) 新規物体認識試験日の識別指数（[(新規物体を調査する時間 – 見慣れた物体を調査する時間) / 総調査時間]*100 として計算)。 0 を超える識別指数は、予想どおり、新しいオブジェクトを調査することを好むことを示します。 GFP 刺激の DI = 33.53 ± 3.80%。 ChR2刺激のDI = 0.049 ± 7.38%。刺激なしの GFP の DI = 33.91 ± 7.13%、刺激なしの ChR2 の DI = 28.55 ± 4.29%。統計的有意性は、ボンフェローニ多重比較補正を備えた反復測定二元配置分散分析を使用して計算されます。 GFP 刺激対 ChR2 刺激 p = 0.0023。 GFP 刺激なし vs ChR2 刺激なし p = > 0.9999。 ChR2 刺激 vs ChR2 刺激なし p = 0.0113。 GFP 刺激 vs GFP 刺激なし p = > 0.9999。

vGlut2BF→LHb回路の光遺伝学的刺激によって引き起こされる強力な嫌悪にもかかわらず、条件付けされた場所の好みが欠如しているため、この回路が嫌悪状態および/または場所の学習と記憶をバイパスしているのか、それとも潜在的に記憶形成を妨害しているのかを疑問に思いました。これをテストするために、（訓練プロセスを混乱させないように）物体の提示に続いて光遺伝学的刺激を行う新しい物体認識記憶タスクを実行しました。興味深いことに、ChR2発現マウスは「見慣れた」物体と新しい物体を区別せず、識別指数は0.049±7.38%であり、vGlut2BF→LHb回路の刺激が記憶形成を妨げることを示している。光刺激なしで訓練された場合、同じ動物が新しい物体と見慣れた物体を適切に区別したため、この効果は可逆的でした（図4c、d）。まとめると、これらのデータは、vGlut2BF→LHb回路が強力な嫌悪感を媒介する一方で、この嫌悪感は記憶に形成されず、他の多くの種類の嫌悪行動のように文脈上の手がかりと関連付けることができないことを示しています。さらに、トレーニング後にこの回路が刺激されると、記憶形成が積極的に阻害されます。

vGlut2BF→LHbニューロンの活性化で観察される劇的な嫌悪表現型のため、我々は次に、この回路の活性化が他の高度な嫌悪状態に典型的なストレスや闘争・逃走のような反応を促進するかどうかを調べた。これをテストするために、vGlut2BF→LHb ニューロンの光遺伝学的活性化後の血漿ホルモン ACTH、コルチコステロン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンのレベルをアッセイしました。ベースライン（光遺伝学的刺激なし）、即効性の闘争・逃走反応を検出するための 5 分間の光刺激直後、および潜在的な遅い作用性ストレス反応を特定するために 5 分間の光刺激期間の 20 分後に血液を採取しました。完全な回復を可能にし、後の時点の混乱を避けるために、各時点は 2 週間隔てられました (図 5a)。採取した全血液から血漿を分離した後、ラジオイムノアッセイを使用して ACTH とコルチコステロンを、HPLC を使用してカテコールアミンを測定しました。重要なことに、ベースラインでは、GFP対照とChR2-EYFP実験動物との間のホルモンレベルに差はなかった(光遺伝学的刺激なし;図5b)。興味深いことに、刺激直後または刺激後20分に測定したホルモンのいずれにおいても、GFPコントロールとChR2-EYFPマウスの間に大きな違いは検出されませんでした（図5c、d）。実際、エピネフリンなどの一部のホルモンは実験の過程でレベルの低下を示しましたが、この効果はGFPグループとChR2-EYFPグループの両方で観察され、採血手順への順応を示している可能性があります（図1）。 5d）。したがって、vGlut2BF→LHb ニューロンの活性化は、ストレスや闘争・逃走反応を誘発することなく、強力な嫌悪行動を誘発します。この光誘発性嫌悪状態は文脈化できず、記憶を損なうという証拠（図4）とともに、これらのデータは、vGlut2BF→LHb回路が瞬間的な「反射のような」嫌悪反応を誘発することを示唆しています。

前脳基底部から外側手綱核までの活性化によって引き起こされる嫌悪感は、ストレス反応を引き起こしません。 (a) ベースライン、刺激後、および刺激後 20 分における血漿収集の実験パラダイム。各時点は 2 週間で区切られます。 (b) GFP コントロールおよび ChR2-EYFP 動物について測定されたすべてのホルモンのベースラインホルモンレベル。複数の対応のない t 検定を使用した統計検定。エラーバーは SEM を表します。 GFP コントロールの場合は n = 6、ChR2-EYFP 動物の場合は n = 7。 ACTH の場合: GFP コントロール = 504.03 ± 158.94 pg/mL、ChR2 動物 = 444.82 ± 146.80 pg/mL (p = 0.9799)。コルチコステロンの場合: GFP コントロール = 437.74 ± 93.38 ng/mL、ChR2 動物 = 376.45 ± 60.59 ng/mL (p = 0.9111)。エピネフリンの場合: GFP コントロール = 677.17 ± 115.04 pg/mL、ChR2 動物 = 639.29 ± 126.13 pg/mL (p = 0.9950)。ノルエピネフリンの場合: GFP 対照 = 873.17 ± 89.83 pg/mL、ChR2 動物 = 719.29 ± 94.81 pg/mL (p = 0.6007)。 (c) ストレス反応ホルモン ACTH およびコルチコステロンのベースライン、刺激後、および刺激後 20 分におけるホルモンレベル。反復測定を使用して統計的有意性を決定多重比較のための Sidak 補正を使用した二元配置分散分析。 GFP コントロールでは n = 6、ChR2-EYFP 動物では n = 7 ACTH の場合: ベースラインでの GFP コントロール = 504.03 ± 158.94 pg/mL、ベースラインでの ChR2-EYFP 動物 = 444.82 ± 145.80 pg/mL、p = 0.9799。刺激後の GFP コントロール = 586.11 ± 129.50 pg/mL、刺激後の ChR2-EYFP = 719.61 ± 77.57 pg/mL、p = 0.8197。 GFP コントロール刺激後 20 分 = 630.24 ± 98.01 pg/mL、ChR2-EYFP 刺激後 20 分 = 628.4 ± 89.46 pg/mL、p = > 0.999。コルチコステロンの場合: ベースラインでの GFP コントロール = 437.74 ± 93.38 ng/mL、ベースラインでの ChR2-EYFP 動物 = 376.45 ± 60.59 ng/mL、p = 0.9111。刺激後の GFP コントロール = 409.17 ± 92.20 ng/mL、刺激後の ChR2-EYFP = 455.90 ± 84.11 ng/mL、p = 0.9575。 GFP コントロール刺激後 20 分 = 306.86 ± 58.40 ng/mL、ChR2-EYFP 刺激後 20 分 = 381.12 ± 33.80 pg/mL、p = 0.8541。 (d) 闘争・逃走ホルモンであるエピネフリンおよびノルエピネフリンのベースライン、刺激後、および刺激後 20 分におけるホルモンレベル。反復測定を使用して統計的有意性を決定多重比較のための Sidak 補正を使用した二元配置分散分析。 GFP コントロールの場合は n = 6、ChR2-EYFP 動物の場合は n = 7。エピネフリンの場合: ベースラインでの GFP コントロール = 677.17 ± 115.04、ベースラインでの ChR2-EYFP 動物 = 639.29 ± 126.13、p = 0.9950。刺激後の GFP コントロール = 365.50 ± 37.82、刺激後の ChR2-EYFP 動物 = 514.14 ± 53.00、p = 0.1278。刺激後 20 分の GFP コントロール = 364.50 ± 39.10、刺激後 20 分の ChR2-EYFP 動物 = 438.00 ± 45.31、p = 0.5698。ノルエピネフリンの場合: ベースラインでの GFP コントロール = 873.17 ± 89.83、ベースラインでの ChR2-EYFP 動物 = 719.29 ± 94.81、p = 0.6007。刺激後の GFP コントロール = 768.83 ± 150.05、刺激後の ChR2-EYFP 動物 = 546.86 ± 42.95、p = 0.4999。刺激後 20 分の GFP コントロール = 628.33 ± 87.80、刺激後 20 分の ChR2-EYFP 動物 = 431.29 ± 58.80、p = 0.2591。

vGlut2BF→LHb回路の活性化が強力な嫌悪行動を誘発し、空腹による摂食を無効にすることを考えると、次に、この回路の光遺伝学的活性化が、絶食マウスが高脂肪（HF; 60％kcal脂肪）食を摂取するのを防ぐのに十分であるかどうかを尋ねました。これは非常に嗜好性が高く、ネズミにとってはやりがいのあるものです。実験に先立って、vGlut2BF→LHb 光遺伝学マウスを、3 日間毎日食事を補うことによって HF 食に慣れさせました。次に、一晩絶食させたマウスを、アリーナの一端に 2 つの餌ゾーンがあるアリーナに配置しました。一方は通常の餌を与え、もう一方は HF 餌を与えました。いずれかの食物ゾーンに入ると、絶食マウスは光刺激を受けますが、アリーナの残りの部分では光刺激を受けませんでした（図6a）。マウスをビデオ録画し、合計 20 分間摂餌量を測定しました。以前と同様に、ChR2発現マウスはチャンバーの光刺激側に強い嫌悪感を示し、ほとんどの時間を非刺激側で過ごしました（図6b; ChR2マウスは時間の78.29±1.89％を非刺激側で過ごしました）刺激/食物側の時間の 11.98 ± 1.60% と比較して、p = < 0.0001)。 ChR2 マウスは、1 回の訪問あたりチャンバーの刺激側に費やす時間も大幅に短くなりました（図 6c; ChR2 マウスは 1 回の訪問あたり 2.16 ± 0.33 秒を費やしましたが、GFP マウスは 1 回の訪問あたり 16.33 ± 2.3 秒を費やしました、p = < 0.0001）。 GFP コントロールと比較した、食事ゾーンまたは HF 食事ゾーンのいずれかの時間。実際、ChR2 マウスは時間の 2.80 ± 0.58% を食事ゾーンに費やし、8.41 ± 1.30% を HF 食事ゾーンに費やしましたが、GFP コントロールは時間の 20.79 ± 2.74% を食事ゾーンに費やし、26.73 ± 2.45 時間を費やしました。 HF 食事ゾーンにいる時間の % (図 6d)。しかし、光刺激ゾーンへの嫌悪にもかかわらず、ChR2動物はGFP対照と同じ総量の正常またはHF飼料を消費しました（図6e;GFPマウスは0.05±0.03gの飼料と0.53±0.05gのHF飼料を消費しましたが、ChR2マウスは摂取しました） 0.03 ± 0.01 g の固形飼料および 0.36 ± 0.09 g の HF 固形飼料）。注目すべきことに、ChR2マウスは、飼料ゾーンまたはHF飼料ゾーンへの訪問時間がはるかに短く（図6f）、GFPコントロールよりも総移動距離が長くなりました（図6g）。したがって、ChR2マウスは採餌戦略を適応させて、餌ゾーンへの移動を短くし、摂食間の光刺激を回避した。また、ChR2 マウスは、HF 食ゾーンへの移動回数が不釣り合いに多くなりました (図 6h)。これらのデータは、嫌悪に関連したvGlut2BF→LHb光刺激の圧力の下で、ChR2動物がより高カロリーでより価値のある食物を探すことを選択することを示唆しています。さらに、ChR2 マウスは、食料ゾーンへの移動時間が短く、より頻繁になり、より速い速度で食料を消費することにより、GFP コントロールと同じ量の食料をより短い時間で消費しました。これらのデータは、外圧に直面したときに効率的に食物を獲得するマウスの行動の柔軟性を部分的に示していますが、根本的な違いも明らかにしています。一方、vGlut2BF→LHb回路によって引き起こされる嫌悪感は、食物との相互作用に費やす時間を短縮し、食物摂取量を急激に減らすのに十分です。 (図3)、この回路の一時的な活性化は食欲には影響しません。つまり、vGlut2BF→LHb回路は嫌悪感を引き起こし、活性化されると摂食行動を無効にする可能性がありますが、この活性化自体は食欲や食べる動機を低下させません。

側手綱核突出グルタミン酸作動性前脳基底ニューロンの活性化は、食べる意欲を無効にしますが、食欲には影響しません。 (a) 食物と組み合わせたvGlut2BF→LHbニューロンの光遺伝学的刺激のための実験セットアップ。 (b) 20 分間の実験中に、GFP コントロールおよび ChR2-EYFP 動物がアリーナの刺激部分または非刺激部分で費やした平均時間の割合。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、ボンフェローニ補正による比例の二項検定を使用して決定されます。帰無仮説 = 50%。 n = 7。GFP コントロールは非刺激側に 43.00 ± 3.45% の時間を費やし、刺激/食物側に 50.71 ± 3.22% の時間を費やしました (p = 0.4705)。 ChR2-EYFP動物は、非刺激側で78.29±1.89%の時間を費やしたのに対し、刺激/食物側では11.98±1.60%の時間を費やしました(p=<0.0001)。 (c) GFP および ChR2-EYFP 動物のチャンバーの刺激側への各訪問の平均継続時間。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は対応のない両側 t 検定を使用して決定されます。 n = 7。GFP 動物は訪問ごとに 16.33 ± 2.3 秒を費やしました。 ChR2-EYFP動物は1回の訪問につき2.157±0.33秒を費やした。 p = < 0.0001。（ d ）GFP対照およびChR2-EYFP動物が、（アリーナの刺激部分内で）固形飼料または高脂肪固形飼料と相互作用するのに費やした時間のパーセント。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、多重比較のための Tukey 補正を備えた二元配置 ANOVA を使用して決定されます。 n = 7。飼料ゾーンでは、GFP コントロールは 20.79 ± 2.74% の時間を費やし、ChR2-EYFP 動物は 2.80 ± 0.58% の時間を費やしました (p = < 0.0001)。高脂肪食ゾーンでは、GFP コントロールは 26.73 ± 2.45% の時間を費やし、ChR2-EYFP 動物は 8.41 ± 1.3% の時間を費やしました (p = < 0.0001)。（ e ）20分間の実験全体にわたるGFP対照およびChR2-EYFP動物の平均累積食物摂取量。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、多重比較のための Tukey 補正を備えた二元配置 ANOVA を使用して決定されます。 n = 7。摂取した餌: GFP 対照 = 0.05 ± 0.03 g、ChR2-EYFP 動物 = 0.03 ± 0.01 g (p = 0.9888)。摂取した HF 食: GFP 対照 = 0.53 ± 0.05 g、ChR2-EYFP 動物 = 0.36 ± 0.09 g (p = 0.1640)。 GFP 飼料対 GFP HF 飼料: p = < 0.0001。 ChR2 飼料対 ChR2 HF 飼料: p = 0.0013。 (f) GFP 対照動物および ChR2-EYFP 動物の飼料ゾーンまたは高脂肪飼料ゾーンへの各訪問の平均時間。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、多重比較のための Tukey 補正を備えた二元配置 ANOVA を使用して決定されます。 n = 7。食事ゾーンへの平均訪問時間: GFP コントロール = 7.11 ± 0.97 秒、ChR2-EYFP 動物 = 1.43 ± 0.25 秒 (p = < 0.0001)。高脂肪食ゾーンへの平均訪問時間: GFP 対照 = 8.49 ± 1.10 秒、ChR2-EYFP 動物 = 2.14 ± 0.31 秒 (p = < 0.0001)。 (g) 20 分間の食物選択実験中の GFP 対照動物と ChR2-EYFP 動物の平均移動距離。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、対応のない両側 t 検定を使用して決定されます。 n = 7。GFP コントロール = 45.66 ± 9.94 m、ChR2-EYFP 動物 = 82.21 ± 28.33 (p = 0.0074)。 (h) GFP 対照動物および ChR2-EYFP 動物のアリーナの飼料ゾーンまたは高脂肪飼料ゾーンへの平均訪問回数。エラーバーは SEM を表します。統計的有意性は、多重比較のための Tukey 補正を備えた二元配置 ANOVA を使用して決定されます。 n = 7。食事ゾーンへのトリップ: GFP コントロール = 41.43 ± 3.36、ChR2-EYFP = 27.14 ± 2.42 (p = 0.0286)。高脂肪食ゾーンへの旅行: GFP 対照 = 44.7 ± 3.1、ChR2-EYFP 動物 = 55.57 ± 4.31 (p = 0.1285)。 GFP 飼料と GFP HF 飼料の比較: p = 0.8987。 ChR2-EYFP 飼料と ChR2-EYFP HF 飼料の比較: p = < 0.0001。

チャネルロドプシンは回路が特定の行動に十分であるかどうかを明らかにしますが、我々はまた、Cre依存性アーキロドプシン（ArchT-GFP）をBFにターゲットし、LHb上の光ファイバーを利用して、光遺伝学的阻害による嫌悪と摂食行動のためのvGlut2BF→LHb回路の必要性もテストしました。 vGlut2BF→LHb末端を阻害するvGlut2-Cre+/-動物の実験。電気生理学的実験により、ArchT による BF 末端の光阻害が LHb 標的細胞へのシナプス伝達を効果的に阻害することが検証されました (補足図 9; 方法を参照)。 in vivo行動アッセイを実施したところ、vGlut2BF→LHb末端の光遺伝学的阻害は、リアルタイムの場所選好表現型をもたらさず、再摂食アッセイにおける食物摂取にも影響を与えなかった(補足図10および11)。脳内の摂食回路と嫌悪回路の冗長性により 27、適切な摂食行動と嫌悪行動を調節するには、vGlut2BF→LHb 回路で十分である可能性がありますが、単独で必要というわけではありません。それにもかかわらず、私たちのデータは、ドライブの読み取りを迅速かつ反射的に無効にすることができる嫌悪回路を明らかに特定しています。

この研究では、vGlut2BF ニューロンが脳の顕著な嫌悪中枢である LHb に強力に投射していることを確認しました。我々は、生体内でのファイバー測光とカルシウムイメージングを用いて、vGlut2BF→LHb回路が嫌悪感や食物関連の感覚信号を含む多様な感覚情報に反応することを発見した。光遺伝学を使用して、vGlut2BF→LHb 投影が強い嫌悪感を引き起こし、食欲に影響を与えることなく食物摂取を無効にすることを観察しました。この嫌悪感は条件付け後に記憶されることはなく、ストレスや闘争・逃走反応を引き起こすこともありませんでした。 vGlut2BF→LHb回路の活性化も記憶形成を損なう。したがって、この BF から LHb への回避回路は、反射的に瞬時に動作します (図 7)。

グラフィカルな抽象。嗅覚情報はBFグルタミン酸作動性回路を介してLHbに伝えられ、嫌悪行動を引き起こし、摂食などの食欲行動を無効にします。

基底前脳は、感覚処理、注意、動機、学習、記憶などのさまざまな機能を持つノードです18、25、28、29、30、31、32、33、34、35。以前、私たちと他の人は、BFが食欲抑制と嫌悪行動に役割を持っていることを独自に明らかにしました12、13、14、26。 BF が異なる動作を引き起こす方法の 1 つは、その差分投影によるものです。 BF の標的には、梨状皮質などの感覚領域、視床下部などの摂食関連領域、扁桃体基底外側、腹側被蓋野、外側手綱核などの報酬/嫌悪関連領域が含まれます 12,13,26。この研究は、嫌悪感と摂食におけるLHbへのBF投射の役割に焦点を当てていましたが、以前の研究では、LHAへのBF投射も嫌悪感と摂食低下を引き起こすことが示されています12。 vGlut2LHA ニューロンも独立して嫌悪感と食欲抑制を駆動することが知られているため、LHA は BF の特に興味深い標的です 10。しかし、vGlut2BF→LHA投影の末端領域の活性化は、BF細胞体によって誘発される嫌悪感を完全には再現しません。これは、LHb などの他のダウンストリームノードが LHA と連携してそのような動作を調整する可能性があることを示しています。

LHbは、嫌悪行動と逃避行動に関与し、ストレスと罰、および罰を予測する感覚信号によって活性化され、動機と報酬によって引き起こされる中脳辺縁系ドーパミン作動性および背側縫線の両方の阻害を通じて全体的に嫌悪状態を引き起こすことが知られています。セロトニン作動性システム15、36、37、38、39、40、41、42。摂食に関しては、LHA の LHb への投射が快楽的な摂食を阻害し、嫌悪行動を引き起こします 9。したがって、LHb は嫌悪回路と摂食回路を統合するための主要な候補として機能します。私たちは、LHb への vGlut2BF 投影を活性化すると、摂食意欲が抑制され、リアルタイムの場所嫌悪感が誘発されることがわかりました。外側手綱核への他の多くの入力は、外側視索前野、腹側淡蒼球、内側中隔、外側視床下部を含めて、刺激されると嫌悪を引き起こします9,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52。 LHb から LHA36 への相互投影の報告もあります。これら 2 つのノード間の相互接続により、脳内のさまざまな嫌悪中枢が同期し、脅威や不適応刺激に対する迅速かつ迅速な行動反応が保証される可能性があります。 BF が上流にあり、LHb と LHA の両方に機能的に接続されているため、BF はさらに相乗的に嫌悪感を制御し、この同期を促進できます。したがって、BF、LHA、および LHb の相互接続性は、嫌悪性情報と食欲性情報を同期させて行動状態の急速な変化を引き起こす興味深い 3 ノード回路を提供します。この研究における操作のほとんどは、BF軸索終末を活性化するためにチャネルロドプシンを使用した機能獲得型光遺伝学的実験を含んでいることに注意することが重要です。この実験方法に対する潜在的な注意点の 1 つは、活動電位が逆伝播する可能性があることです。しかし、以前に観察されたBF光遺伝学的刺激の食欲低下表現型12は、この研究で観察されたより広範な嫌悪表現型とは異なり、これが我々の実験では当てはまらない可能性が高いことを示しています。また、標的アーキロドプシン刺激によるLHb内の終末電場阻害による摂食の促進および/または嫌悪感の抑制ができないことは、真の機能喪失操作を決定的に証明するものではない。これは、回路のこのノードだけではそのような動作を制御できない可能性があります。あるいは、このアプローチを使用してこのノードでの通信を効果的に沈黙させるのは技術的なハードルであると考えられる場合もあります。

BF は感覚の処理と統合において重要な役割を果たしており、嫌悪性および食欲性の感覚刺激に反応することが示されています 12,17,18,30,31,32,34。遺伝的にコード化されたカルシウムインジケーターとファイバー測光を使用して、vGlut2BF→LHb投射、およびBF入力を受けるLHb細胞が多様な感覚刺激に応答することを観察しました。 LHb は、嫌悪刺激や嫌悪予測刺激、報酬刺激などのさまざまな種類の感覚刺激によって活性化されることが以前に示されています 41,44,53,54,55。したがって、多様な感覚情報を LHb に中継するルートの 1 つは、おそらく BF 経由であると考えられます。

多様な感覚刺激は、vGlut2BF→LHb 軸索終末と BF 入力を受け取る LHb 細胞の両方を活性化します。注目すべきことに、LHb細胞応答がBF末端応答よりもはるかに鋭く、大きさが大きかったことは興味深い。これは、体細胞末端と軸索末端から記録するときの信号対雑音比の違いによる技術的な側面である可能性もあれば、生理学的差異を示している可能性もあります。たとえば、BF 端末は感覚信号に対する応答の同期性が低く、臭気応答が長くなる可能性がありますが、LHb 細胞はより均一かつ迅速に応答する可能性があります。重要な問題の 1 つは、嫌悪感と食欲の感覚信号にそれぞれ反応する BF/LHb 集団が同じなのか、それとも異なるのかということです。ファイバー測光によって集団反応の合計のみを測定することによって、この問題に対処することは困難です。どちらのノードも異種の細胞タイプで構成されており、異なる部分集団が報酬刺激と嫌悪刺激に反応する可能性があります 53,56。しかし、これらのノードが中性臭気にも反応することを考慮すると、この回路が感覚情報に対して広範囲に、または非選択的に反応する可能性もあります。 vGlut2BF→LHb回路は、異なるメカニズムを通じて嫌悪感と食物摂取抑制を独立して調節するため、食物関連の匂いと嫌悪感のある匂いの両方によって活性化される可能性があります。同様に、中性の匂いに対する反応は、顕著な感覚情報を報酬中枢と嫌悪中枢に伝える際のBF投影の役割を示している可能性があります。したがって、vGlut2BF→LHb 投影に、食欲または嫌悪の合図にそれぞれ応答する機能的に異なるアンサンブルが含まれているかどうかを判断することが重要です。あるいは、vGlut2BF→LHb の投影が感覚情報に幅広く反応する場合、他のどの脳領域がこの感覚情報に価数を割り当てるかを決定することが重要になります。たとえば、BF の追加の下流ターゲットを通じて、または LHb への他の入力を通じて。

嫌悪刺激は通常、さまざまな感覚および文脈上の手がかりとの関連を形成します。さらに、そのような極端な嫌悪行動はストレス反応を引き起こすと予想されます。したがって、vGlut2BF→LHb嫌悪が文脈上の合図と関連付けられなかったり、ホルモンストレス反応を引き起こしたりできないことは、いくぶん驚くべきことである。しかし、独立した研究では、BF細胞体によって引き起こされる嫌悪感も条件付けされた場所の好みを促進しないことが明らかにされており、BFによって引き起こされる嫌悪感は記憶されていないようであることが示されています。さらに驚くべきことに、新規物体認識トレーニング後のvGlut2BF→LHb回路の光遺伝学的刺激は物体識別を完全に損ない、これはvGlut2BF→LHb回路が記憶形成を能動的に阻害することを示している。これは挑発的ではあるが、瞬間的な嫌悪感を引き起こし、記憶の固定化を阻害する回路の進化の目的は何なのかという疑問を提起する。おそらく、vGlut2BF→LHb による嫌悪感の反射的かつ瞬間的な性質は、すべての行動機能と認知機能を混乱させ、即時的な嫌悪反応を促進するこの回路の能力に由来しているのでしょう。この信号伝達がなくなると、学習や記憶などの認知機能、あるいは摂食などの動機付けられた行動が起こる可能性があります。他の研究でも、LHb の活性化または阻害のいずれかが状況条件付けを損なうことが示されているため 57、おそらく LHb シグナル伝達の障害は学習と記憶を損なうのに十分であると考えられます。記憶に対するこれらの効果は、ChR2発現マウスがリアルタイムの場所回避アッセイ中に光刺激ゾーンに継続的に戻り、嫌悪感が引き起こされたにもかかわらず、GFP対照と同じ回数の移動を行うという我々の観察と一致する。これらのデータの考えられる解釈の 1 つは、vGlut2BF→LHb 回路の活性化により衝動性が増加し、そのためにマウスが学習できなくなり、マウスが繰り返し嫌悪ゾーンに入る原因となるというものです。最後に、ChR2 発現マウスは光遺伝学的刺激直後に通常の食物摂取を再開するため、急性ストレスを受けた動物は食欲を失うため、vGlut2BF→LHb 回路の活性化は動物にストレスを与えるとは思われません 58。総合すると、学習および記憶アッセイとホルモンデータは、vGlut2BF→LHb 回路が他の嫌悪行動とは異なる反射的嫌悪を引き起こすことを示しています。

嫌悪性の光刺激領域で食物を摂取するようチャレンジされた場合、vGlut2BF→LHb 光遺伝マウスは行動戦略を適応させて食物ゾーンへの短時間だが頻繁な移動を行い、短時間でできるだけ多くの食物を消費できるようにし、結果として同様の食物を得ることができる。対照としての摂取レベル。累積食物摂取量は影響を受けないため、これは、vGlut2BF→LHb回路を活性化すると、食欲や全体的な食物摂取量に影響を与えることなく食物摂取が抑制されることを示しています。この結果は、マウスがアリーナ全体で継続的に刺激された場合の明らかな摂食抑制とは対照的です（図3cのように）。これらの対照的な結果の説明の 1 つは、マウスが競技場の特定のゾーンでのみ刺激された場合、マウスは短期間で摂食行動を開始でき、嫌悪性の光刺激が最大限に活性化されると非刺激ゾーンに逃げることができるということです。一方、継続的に光刺激を与えた場合、マウスは摂食を開始しないため、GFP コントロールと比較して食物消費量が少なくなります。これらのデータは、vGlut2BF→LHb回路が主に食欲に影響を与えることなく摂食行動を無効にする嫌悪表現型を駆動するという解釈を裏付けています。したがって、食物摂取の抑制は嫌悪行動に次ぐものです。しかし、別の解釈は、vGlut2BF→LHb回路が摂食抑制と嫌悪の両方において別個の機能を持っているということです。この別の解釈は、食物関連の合図と嫌悪の合図の両方に対する臭気反応を明らかにするファイバー測光データと、多くの嫌悪回路が闘争・逃走反応を引き起こすため、光遺伝学的刺激後にホルモン・ストレス反応が欠如していることを示すデータによって裏付けられています。ストレスホルモンの分泌。おそらく、摂食抑制と嫌悪は、通常、異なる発火率、神経反応の大きさ、または異なる神経細胞集団の動員によって区別される。しかし、BF→LHb集団全体が特定の周波数で発火する光遺伝学的刺激の人為的な性質により、生理的なvGlut2BF→LHbシグナル伝達が隠蔽される可能性があります。それにもかかわらず、これらのデータは、vGlut2BF→LHb回路が強力な反射的嫌悪感と急激な摂食抑制の両方を駆動するのに十分であることを示しています。

要約すると、我々は、摂食行動を無効にする強力な反射的嫌悪感を引き起こす前脳基底回路を特定し、調べました。この嫌悪の反射的な性質は独特であり、嫌悪回路がどのように動機付けられた行動と競合して、生来の嫌悪刺激に対する迅速な反応を促すかについての私たちの理解を変えます。さらに、この研究は、嫌悪/報酬および感覚処理が恒常性回路とどのように相互作用して摂食行動と体重を変化させるかについて重要な洞察を提供します。進化の観点から見ると、採餌、摂食、生殖などの生存に不可欠な動機付けられた行動は、新しい環境や異質な環境に対する警戒心と、報酬や危険を示す環境の合図への認識によってバランスがとれていなければなりません。したがって、脅威が存在する場合、必要に応じて、脳内の多数の嫌悪および逃避神経回路が給電回路を無効にするように配線されなければなりません。これらの回路がどのように機能し、解剖学的に接続されているかを研究することで、健康に直接的に大きな影響を与える肥満や摂食障害などの壊滅的な疾患や、その他多くの有害な副作用をよりよく理解し、治療できるようになります59,60。さらに、LHb は依存症、気分障害、統合失調症に関与しているため、この嫌悪ノードに対する BF 回路の影響を理解することは、他の種類の精神疾患の理解に役立つ可能性があります。

マウス:

vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl)

出典: ジャクソン研究所

株番号: 016963

野生型 C57BL/6NJ

出典: ジャクソン研究所

株番号: 005304

AAV:

Cre 依存性シナプトフィジン: AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA

血清型: DJ8

出典: Jan Duncan および Dan Duncan 神経研究所の神経接続コア

Cre 依存性 ChR2: AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA

血清型: 2/9

出典: Jan & Dan Duncan Neuroological Research Institute の Neuroconnectivity Core。 Addgene #26973 からサブクローニングされたプラスミド

Cre 依存の mRuby: AAV-Ef1α-flex-mRuby2

血清型: DJ8

出典: Jan & Dan Duncan Neuroological Research Institute の Neuroconnectivity Core。 Addgene #40260 からサブクローニングされたプラスミド

Cre 依存性 GFP: AAV-Ef1α-flex-eGFP

血清型: DJ8

出典: Jan & Dan Duncan Neuroological Research Institute の Neuroconnectivity Core。 Addgene #28304 からサブクローニングされたプラスミド

Cre 依存性 GcaMP: AAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA

血清型: DJ8。

出典: Jan & Dan Duncan Neuroological Research Institute の Neuroconnectivity Core。 Addgene #10083962 のプラスミド

AAV1-Cre: AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA

血清型: 2/1 (順行性)

出典: Addgene #105553 (U Penn Viral Core)

Cre 依存性 ArchT: AAV-CAG-flex-ArchT-GFP

血清型: 2/9

出典: Jan & Dan Duncan Neuroological Research Institute の Neuroconnectivity Core。 Edward Boyden の研究室の Adddgene #28307 からのプラスミド 63

この研究で使用されたマウスは、米国保健福祉省および IACUC に従って治療されました。すべての実験プロトコルは、プロトコル番号 AN5596 でベイラー医科大学および認可された BCM IACUC プロトコル承認委員会によって承認されました。すべての方法は、ARRIVE ガイドラインの推奨事項に従って報告されています。すべての実験では、雄と雌の両方の同腹子が使用され、実験群と対照群の両方に分配されました。定位固定手術には少なくとも8週齢のマウスを使用し、生後3〜5か月のマウスで行動を実施した。動物は12時間の明暗サイクルで維持され、集団飼育された。マウスには標準的なマウス飼料（Harlan、2920X）を与え、この飼料または高脂肪飼料（60% kcal 脂肪、Research Diets Inc 12492）を給餌実験に使用しました。 vGlut2-Cre (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J ストック番号 01696364) マウスは、Jackson Laboratories から購入しました。 vGlut2-Cre のジェノタイピングは、Jackson Laboratories の次のプライマーを使用して行われました: ミュータントリバース「ACA CCG GCC TTA TTC CAA G」(プライマー 13007)、共通「AAG AAG GTG CGC AAG ACG」(プライマー 32667)、および野生型リバースCTG CCA CAG ATT GCA CTT GA」（プライマー 32668）。ヘテロ接合体（vGlut2-Cre+/-）を得るために、vGlut2-Creホモ接合マウス（vGlut2-Cre+/+）をC57BL/6NJ野生型マウス（Jackson labs Stock No. 005304）と交雑させた。

すべての定位固定手術では、マウスを麻酔し、約 1 ～ 3% の気化イソフルランと酸素を使用して麻酔下に維持しました。 Angle Two ソフトウェアに接続された定位固定装置を使用して、脳の領域を正確に標的にしました。 ML 方向と AP 方向の両方 (+/- 0.03 mm 以内) で頭蓋骨を水平にした後、経験的に決定された座標を使用してさまざまな領域をターゲットにしました。脳の傾きを調整するために AP 座標をわずかに前方にシフトし、定位固定手術実験の前に diI 注射を使用して最適化された座標を検証しました。これに向けて、ブレグマからの両側注射を通じて前脳基底部、AP = 1.18 mm、DV = − 5.8 mm、および ML = ± 1.29 mm をターゲットにしました。すべての実験では、片側あたり 150 nL のウイルスを使用し、ウイルスはブレグマ 0.97 からブレグマ 0.50 までの内側前脳基底部領域に濃縮されました。解剖学的トレース実験には、AAV-Ef1α-flex-Synaptophysin::mRuby2-WPRE-hGHpA (血清型 DJ8) を使用しました。チャネルロドプシン支援回路マッピングの場合、光支援活性化には AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (血清型 2/9) が使用され、AAV-Ef1α-flex-mRuby2 (血清型 DJ8) は記録元のセルにラベルを付けるために使用されます。 ArchT-GFP の電気生理学的検証のために、AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (血清型 2/9) を AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (血清型 2/9) と混合しました。体積比は 1:1。光遺伝学的行動アッセイでは、機能獲得実験動物には AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (血清型 2/9) を使用し、AAV-Ef1α-flex-eGFP (血清型 DJ8) を使用しました。対照として、AAV-CAG-flex-ArchT-GFP (血清型 2/9) を機能喪失実験に使用しました。カルシウムイメージング実験には、AAV-Synapsin-flex-jGCaMP8s-WPRE-pA (血清型 DJ8) および/または AAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA (血清型 2/123) を使用しました。すべてのウイルスの力価は少なくとも 1011 ウイルス粒子/μL でした。

ウイルス注射後少なくとも 2 週間で、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、PBS、続いて 4% PFA (16% パラホルムアルデヒド EM Grade No. 15710 Electron Microscopy Sciences を使用して希釈) を経心的に灌流しました。脳を解剖し、4% PFA中で4℃で一晩さらに滴下固定し、続いてPBS中の20%スクロース中で一晩凍結保護し、最後にPBS中の30%スクロース中で4℃で一晩凍結保護した。次に、凍結保護された脳をOCT（Fisher HealthCare No. 4585）に包埋して凍結し、切片を作成するまで-80℃で保存しました。脳を、クライオスタット（ライカＣＭ１８６０）上で、ウイルス追跡／標識実験のために４０μｍで、事後の光ファイバー移植部位の決定のために８０μｍで、前方から後方方向に冠状にスライスした。 40 μm でスライスする場合は、3 つおきの切片を収集しました。 80μmでスライスした場合、すべての切片が収集されました。 PBS で洗浄した後、スライスをスライドにマウントし、DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech、0100-20) を使用して染色しました。画像は、10 倍または 20 倍の Leica TCS SPE 共焦点顕微鏡、Leica TCS SP8 STED 顕微鏡、または Leica SP8X 顕微鏡のいずれかを使用して撮影されました。すべてのタイル画像は 10 倍で撮影されました。 BF synaptophysin::mRuby2 標識の定量化のために、3 匹の動物の嗅球から小脳までの脳全体を分析しました。 synaptophysin::mRuby2 標識が観察された領域では、動物内の異なるスライスにわたる領域 (Allen Brain Atlas を使用して特定) ごとに 3 つの画像が撮影されました。蛍光シグナルは、Imaris を使用してポストホックに定量化されました。Imaris では、関心領域 (ROI) 上にマスクが描画され、バックグラウンドシグナルが減算されて、シナプトフィジン::mRuby2 末端の体積を ROI の総体積で割った値が計算されました。次に、動物内の技術的複製を平均して生物学的複製平均を作成し、これを生物学的複製全体の全体的な平均 synaptophysin::mRuby2 密度を計算するために使用しました。

スライスの電気生理学的記録実験は、若干の変更を加えて前述したように実行されました 65。簡単に説明すると、マウスをイソフルランで深く麻酔し、次に、125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、2 CaCl2、25 グルコース、および 25 重炭酸塩を含む氷冷人工脳脊髄液 (aCSF) 溶液を経心臓的に灌流しました。 (pH 7.3、295 mOsM)。脳を取り出し、（mMで）2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、10 MgSO4、0.5 CaCl2、234スクロース、11グルコース、および26重炭酸塩を含む氷冷切断溶液に移した。切削液を 95% CO2/5% O2 で連続的にバブリングしました。脳を1.5%の低融点アガロースに冠状に埋め込んだ。寒天に包埋された脳は、ライカ VT1200 ビブラトーム上で酸素を添加した切断溶液に直ちに浸されました。３００マイクロメートルの冠状切片を０．４ｍｍ／秒の切断速度で作製した。スライスを酸素化aCSFのスライス回収チャンバーに移し、37℃で少なくとも30分間放置した。回復後、スライスを記録前に 30 分間かけてゆっくりと室温に戻しました。

LHb への前脳基底部グルタミン酸作動性入力の光遺伝学的回路マッピングのために、vGlut2+ LHb 細胞を mRuby2 標識によって同定し、パッチを適用しました。パッチを当てた細胞を最初に-65 mVで電圧固定し、ベースラインの膜特性を記録しました。光誘起内向き電流の存在を確認するために、チャネルロドプシンを、フィルタリングされたキセノン光源（Olympus、U-N41020）からの全視野照明によって活性化した。光刺激の開始と継続時間は、ClampEx ソフトウェア (バージョン 10.3) を介して機械シャッター (Sutter) によって制御されました。次に、パッチを適用したセルを 0 mV で電圧固定し (接合電位を調整)、外向き電流を明らかにしました。光誘起外向き電流が aCSF で観察された場合は、TTX (1 μM)、4AP (0.5 μM)、および CNQX (10 μM /APV (50 μM)) を連続的に浴適用して以下を確認しました。(1) 活動電位依存性、(2) 単シナプスの性質、および (3) 誘発電流のグルタミン酸受容体依存性。

ArchT 刺激を介して vGlut2BF→LHb 回路を阻害する能力を検証するために、AAV-CAG-flex-ArchT-GFP と AAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA の体積比 1:1 混合物を注入しました。上記の仕様に従って、LHb 内の細胞から全細胞電位固定記録を実行しました。 470 nmの光を使用してBF終末におけるChR2のシナプス前刺激に応答したものを特定した後、ArchT阻害がChR2誘発発火を抑制するかどうかをテストしました。これに向けて、565 nm の光が持続期間にわたって継続的に照射されました。次に、ArchT の光阻害中に、ChR2 を連続的に刺激 (470 nm の光) して、ArchT が ChR2 誘発発火を抑制するかどうかをテストしました。最後に、ArchT 刺激を中止し、ChR2 刺激を使用してシナプス後 LHb 細胞を可逆的に再活性化しました。

BF軸索末端カルシウムイメージング実験のために、上記の座標を使用して、雄および雌のvGlut2-Cre+/-同腹子にrAAV-Syn-flex-GCaMP8s-WPRE-hGHpA62をHDBに両側注射した。 LHb 細胞体カルシウムイメージングでは、rAAV1-hSyn-Cre-WPRE-pA を HDB に両側に注入し、rAAV-Syn-flex-GcaMP8s-WPRE-hGHpA を左 LHb に注入しました。ウイルス注射と同時に、ブレグマ AP = − 1.45、ML = − 0.45、および上記と同じプロセスを使用して、DV = − 2.60。さらに、アルミニウムのヘッドプレートを頭蓋骨の後部にセメントで固定し、匂い提示中にマウスの頭部を回し車に固定できるようにした。ファイバー測光記録が続く前に、マウスを3週間治癒させてウイルスを発現させた。

ファイバー測光記録中、マウスの頭を鼻から約 6 cm の位置に配置した嗅覚計 22 を備えた回し車に固定しました。提示された臭気物質には、キツネの尿 (Predator Pee)、固形飼料 (5V5 の飼料を砕いて鉱油に溶解)、メチルブチルアミン (Sigma 241407)、カダベリン (Sigma 52063)、酪酸 (Sigma B103500)、R(+)-リモネン (Sigma) が含まれていました。 183164)、S(-)-リモネン (Sigma 218367)、ローズオイル (Rainbow Abby)、およびピーナッツバター (Justin's)。すべての臭気は、体積あたり 2% の濃度でミネラルに溶解され、ランダムな順序で 10 回反復して提示されました。鉱油のみを陰性対照として使用した。 5V5 の固形飼料臭気物質を除いて、すべての臭気は新規でした。

ファイバー測光記録は、66 に記載されている Doric システムを使用して行われました。簡単に説明すると、2 つの発光ダイオード (波長 465 および 405 nm) が光ファイバーケーブル (コア 400 um、NA = 0.48) によってフィルターキューブに接続されました。フィルターキューブは励起波長と発光波長を分離し、フェルールスリーブを使用してマウスに埋め込まれた光ファイバーに接続された別の光ファイバー (コア 200 um、NA = 0.48) に沿って励起波長を指向させました。発光波長は、同じファイバーに沿ってマウスからフィルターキューブまで運ばれ、その後、光ファイバーケーブル（600 umコア、NA = 0.48）を通じてフェムトワット光検出器（Newport）に送られました。励起と発光は、それぞれ Doric Studio ソフトウェアで制御および記録されました。 jGCaMP8s を 465 nm で励起し、神経活動を示すカルシウムの動態を記録しました。 GCaMP の等吸収点である 405 nm で同時に励起し、カルシウム結合の影響を受けない発光を収集しました。これは、モーションアーティファクトやその他のカルシウムに依存しないノイズを制御するために使用されました。制御チャネル (405 nm) と実験チャネル (465 nm) から同時に記録するために、各 LED が異なる高周波数 (通常はそれぞれ 270 Hz と 500 Hz) で変調される「ロックイン」戦略を採用しました。両方の励起モードから生じる放射は同じ光検出器によって記録され、信号は Doric Studio でオンラインで復調され、実験チャネルから制御チャネルが分離されました。その後、Doric スタジオで分析ツールを使用して両方の信号を dF/F に変換し、ノイズを低減するために制御チャンネルと実験チャンネルを差し引きました。 Z スコアの dF/F は、各匂い提示の前後 5 秒間と 20 秒間で計算されました。臭気は 2 秒間提示され、その後 18 秒の試行間隔が続きました。ヒートマップは MATLAB (バージョン R2019a) で生成されました。 Arduino で生成された TTL パルスは嗅覚計をトリガーし、ファイバー測光記録と匂いの提示を正確に調整するための記録中にデジタル入力として使用されました。個々のマウスごとに 10 回の技術的複製を平均化したら、生物学的複製をまとめて平均して複合平均を作成します。平均 Z スコア応答は、臭気送達前 3 秒間 (ベースライン) と臭気送達後 3 秒間で計算されました。次に、平均ベースライン応答が臭気応答から差し引かれ、すべての臭気にわたってベースラインで正規化された臭気応答が生成されました。次に、正規化された臭気反応を 0 (帰無仮説) と比較して、1 サンプルの t 検定を使用して統計的有意性を計算しました。

光遺伝学インプラントの場合、生後 8 週目の vGlut2-Cre+/- マウスに、rAAV-Ef1α-flex-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-hGHpA (血清型 2/9)、rAAV-Ef1α-flex- を BF に定位的に両側から注射しました。 GFP (血清型 DJ8)、または rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP (血清型 2/9)。 1週間後、Patel and Swanson 201967に記載されているように、カスタムメイドの光ファイバーインプラントをLHb上でマウスの両側に移植しました。簡単に説明すると、200 umコアの光ファイバーケーブル（0.22 NA、FG200AEA）を剥がし、230 umフェルールに固定しました。 (Thor Labs CFLC2301-10)、UV 光硬化エポキシ (Bondic) を使用。インプラントは 3.5 mm にトリミングされ、高い光出力 (少なくとも 1 mW) を確保するためにインプラントの平らな端が研磨されました。外側手綱核は、ブレグマ AP = − 1.58、ML = ± 0.34、および DV = − 2.85 からの座標で 15 度の角度で両側に移植されました。光ファイバーインプラントはセメント (C および B Metabond Dental セメント、Parkell) を使用して固定され、架橋フラッシュアクリル (Yates-Motloid 44115 および 44119) でキャップされました。 18ゲージの針を長さ約1インチに切り取り、頭蓋骨の後部にアクリルで固定して、擦り傷を付けずにマウスをパッチケーブルに取り付け、代わりにリング鉗子を使用してマウスをパッチケーブルに取り付けた。インプラント手術後、マウスを 2 週間回復させてから行動実験を行った。

雄および雌の vGlut2-Cre+/- 同腹子に、rAAV-flex-ChR2-EYFP または rAAV-flex-GFP を BF に定位注射し、LHb 上に光ファイバーを埋め込んで BF 末端を刺激しました。 2週間の回復後、マウスを一晩絶食させた。翌日、マウスをパッチケーブルに取り付け、実験を開始する前に5分間単独の行動チャンバーに順応させました。順応後、個々のマウスに餌を与え、20 Hz、5 ms パルスで 473 nm レーザー (ドーリック式、出力少なくとも 1 mW) で 5 分間光刺激しました。 5 分後、レーザーがオフになり、食品の重量が測定されました。次に、マウスに光刺激を与えずに５分間餌を摂取させた。これをもう一度繰り返し（光刺激ありで５分間、続いて光刺激なしで５分間）、総持続時間２０分間、食物摂取量を５分ごとに計量した。各時点の平均食物摂取量を計算し、ChR2 対照群と GFP 対照群を反復測定二元配置分散分析によって比較しました。

ArchT-GFP マウスについては、rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP を使用した以外は上記と同じ定位手術を実施しました。回復後、マウスを一晩絶食させ、光ファイバーケーブルに接続し、餌を与え、光刺激を与えずに20分間餌を摂取させてベースライン食物摂取量を計算した（食物の重量を5分ごとに測定した）。翌週、同じマウスを一晩絶食させた後、餌を与えながら、1 Hz、900 ms パルスの 561 nm レーザー (CrystaLaser) で 20 分間連続して光阻害を行いました。食物の重量を５分ごとに測定した。各時点の平均食物摂取量を計算し、反復測定二元配置分散分析によって「刺激なし」グループと「刺激あり」グループを比較しました。

雄と雌の vGlut2-Cre+/- 同腹子に、rAAV-flex-ChR2-EYFP、rAAV-flex-GFP、または rAAV-CAG-flex-ArchT-GFP を BF に定位注射し、刺激するために LHb 上に光ファイバーを埋め込みました。 BF端子。 2 週間の回復後、マウスをパッチケーブルに接続し、大きな長方形のアリーナ (25 インチ x 17 インチ) に配置しました。マウスを 5 分間順応させた後、アッセイを開始しました。動物の動きは、オープンソースソフトウェア Bonsai68 と連携するカメラを使用して追跡されました。Bonsai68 は、マウスが事前に設定された ROI 内にいついることを検出できました。次に、このソフトウェアは、マウスがこの領域にあるときに、レーザー光刺激用の TTL パルス (ChR2 マウスの場合は 473 nm 光、20 Hz、5 ms パルス、ArchT マウスの場合は 561 nm 光、1 Hz、900 ms パルス) をトリガーしました。このソフトウェアを使用して、マウスはビデオ録画されながら、合計 20 分間自由に歩き回りながらアリーナの半分で光刺激されました。条件付けされた場所を好むために、このパラダイムを 3 日間連続で繰り返し、試験日には光刺激なしで繰り返しました。リアルタイムおよび条件付きの場所回避の両方について、アリーナのどちらかの半分で費やされた時間は、MATLAB69 のオープンソースソフトウェア Optimouse を使用して事後的に計算されました。統計的有意性は、マウスが競技場の両半分で時間の 50% を費やすという帰無仮説を用いた二項検定を使用して決定されました。ヒートマップは、Noldus EthoVision (XT 16) ソフトウェアを使用して生成されました。

状況に応じた恐怖条件付けは、いくつかの小さな修正を加えて、前述したように実行されました70。簡単に説明すると、マウスを 3 日間 1 日あたり 3 分間扱い、その後 2 日間連続して 20 分間コンディショニングチャンバーに慣らしました。訓練当日、壁に視覚的状況マーカーを備えたチャンバーにマウスを置き、2分間順応させた(ナイーブ)。次いで、マウスは90秒間隔で2回の足ショックを受けた(それぞれ0.75mA、2秒)。 1分後、マウスをホームケージに戻した。 2 時間後および 24 時間後、マウスを条件付けチャンバーに 5 分間戻し、それぞれ短期記憶と長期記憶をテストしました。この間、FreezeView によって分析されたリアルタイムビデオを使用して、すくみ反応 (不動) が記録されました。統計的有意性は、多重比較のための Sidak 補正を備えた反復測定二元配置分散分析を使用して測定されました。

新しいオブジェクトの認識は、以前に説明したように 71 若干の変更を加えて実行されました。訓練前の 3 日間、マウスを黒色のプラスチック製チャンバー (37 × 37 × 37 cm) と光遺伝学的光ファイバーケーブルに 1 日あたり 10 分間慣れさせました。訓練日には、マウスを光ファイバーケーブルに接続し、2つの同一の物体を10分間探索させた。この訓練後、物体を取り除き、マウスを 20 Hz (5 ms パルス) で 10 分間光刺激し、その後ホームケージに戻しました。 24時間後（試験日）、マウスを光ファイバーケーブルに接続し、前日の物体1つ（見慣れた物体）と、ほぼ同じサイズの新しい物体1つ（新規物体）を10分間提示した。 AnyMaze ソフトウェア (バージョン 6.2) を使用して、実験的処置を知らされていない訓練を受けた実験者によって、いずれかのオブジェクトを調査した時間が記録されました。マウスは、対象物から半径 2 cm 以内で鼻を嗅いでいる場合、その対象物を調査していると定義されました。これらのデータから、新しいオブジェクトから見慣れたオブジェクトの調査に費やした時間を差し引き、パーセンテージとして総調査時間で割ることにより、識別指数を計算しました [(新しいオブジェクトの調査時間 - 見慣れたオブジェクトの調査時間)/(新しいオブジェクトの調査時間]光刺激効果の可逆性をテストするために、同じアッセイを 1 週間後に光刺激を行わずに、見慣れた物体と新しい物体の異なるセットを使用して実行しました。統計的有意性は、多重比較のためのボンフェローニ補正を備えた反復測定二元配置分散分析を使用して決定されました。

ホルモン測定用の血漿は 3 つの時点で収集されました。(1) ベースラインでは、動物を光ファイバーケーブルに接続し、取り扱いストレスを洗い流すために 2 時間順応させた後、ケーブルから取り外し、すぐに血液を収集しました。 (2) 刺激後、動物を光ファイバーケーブルに取り付け、2 時間順応させ、20 Hz (5 ms パルス) で 5 分間刺激し、取り出してすぐに血液を採取する、または (3) 刺激後 20 分この実験では、動物をケーブルに取り付け、2 時間順応させ、5 分間刺激し (20 Hz、5 ms パルス)、20 分間休ませた後、取り出して血液を採取しました。これら 3 つの時点は、採血のストレスの多いプロセスによる混乱を招く結果を回避し、採血と採血の間に動物が失血から回復する時間を確保するために 2 週間の間隔をあけて配置されました。血漿は、ランセットで顎下静脈を穿刺し、全血をEDTA処理バイアルに収集することによって収集されました。カテコールアミン (エピネフリンおよびノルエピネフリン) については、防腐剤として使用するために、ヴァンダービルト大学ホルモンアッセイおよび分析サービスコア仕様に従って EGTA-グルタチオン溶液を調製しました。簡単に説明すると、4.5 g EGTA と 3.0 g グルタチオンを 50 mL dIH2O (pH 6.0 ～ 7.4) に溶解しました。 EGTA-グルタチオン溶液を、採血直後に1:50の濃度でカテコールアミンチューブに添加した。血液を4℃、14,000gで15分間遠心して血漿を単離した。血漿は上層から除去され、急速冷凍され、ホルモン分析のために Vanderbilt Hormone and Analytics Core に送られるまで -80 °C で保存されました。 ACTHおよびコルチコステロンのレベルは、二重抗体手順によるラジオイムノアッセイを使用して測定し、カテコールアミンであるノルエフィネフリンおよびエピネフリンは、電気化学的検出によるHPLCを使用して測定しました。統計的有意性は、多重比較のための Sidak 補正を備えた反復測定二元配置分散分析を使用して測定されました。

雄および雌の vGlut2-Cre+/- 同腹子に、rAAV-flex-ChR2-EYFP または rAAV-flex-GFP を BF に定位注射し、LHb 上に光ファイバーを埋め込んで BF 末端を刺激しました。マウスを一晩絶食させ、大きな長方形のアリーナ（25インチ×17インチ）に置き、そこで5分間順応させた。アリーナの片側では、固形飼料が 1 つの隅にしっかりと置かれ、高脂肪の固形飼料が隣の隅にしっかりと置かれていました。オープンソースを使用します。

Bonsai68 では、光刺激はアリーナの食物側に沿った ROI に限定され、食物を摂取または相互作用している間にマウスを光刺激するのに十分な大きさでした。マウスをビデオ録画し、摂食量を合計 20 分間記録しました。 ChR2-EYFP マウスと GFP マウスの両方について、固形飼料と高脂肪固形飼料の両方の平均食物摂取量を計算し、二元配置分散分析を使用して比較しました。アリーナの刺激側で費やした時間、およびいずれかの食品の選択と相互作用するのに費やした時間は、MATLAB69 の Optimouse を使用して事後計算され、二元配置分散分析を使用して比較されました。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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これらの実験で使用した AAV の製造については、Joshua Ortiz-Guzman 博士、Jennifer Selever 博士、および Neurological Research Institute Viral Core (Zihong Chen および Ying Wang を含む) に特別に感謝します。さらに、この原稿の編集に協力し、協力してくれた Arenkiel 研究室のメンバーに感謝します。記載されているプロジェクトは、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所 (助成金番号 R01DK109934) および米国国防総省 (助成金番号 DOD W81XWH-19-1-0429) から BRA および QT、1R01DK131446 への複数の PI 賞を通じて支援されました。 QT への R01 DK120858、BRA への R01 NS078294 および UF1NS111692、およびベイラー医科大学の神経接続性および神経可視化コア。これらは、ユーニスケネディシュライバー国立小児保健人間開発研究所からの IDDRC 助成金番号 P50 HD103555 によってサポートされています。説明されているプロジェクトは、NIH 助成金 DK059637 (MMPC) および DK020593 (DRTC) によってサポートされている Vanderbilt Hormone and Analytics Core によって部分的に支援されています。内容は著者のみの責任であり、必ずしもユーニス・ケネディ・シュライバー国立成育医療人間開発研究所、国立衛生研究所、または国防総省の公式見解を表すものではありません。また、関連研究に対する継続的かつ寛大な支援をしていただいたマクネア医学研究所とチャリフ・ソーキにも感謝いたします。

米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学分子および人類遺伝学科

ジェシカ・L・スワンソン、ジョシュア・オルティス＝グスマン、スニグダ・スリヴァスタヴァ、ショーン・W・ドゥーリング、エリザベス・ハンソン・モス、ミハイル・Y・コチュコフ、パトリック・J・ハント、ブランドン・T・ペカレック、ベンジャミン・R・アレンキエル

ジャンおよびダン・ダンカン神経学研究所、テキサス小児病院、米国テキサス州ヒューストン

ジェシカ・L・スワンソン、ジョシュア・オルティス＝グスマン、スニグダ・スリヴァスタヴァ、エリザベス・ハンソン・モス、ミハイル・Y・コチュコフ、パトリック・J・ハント、ジェイ・M・パテル、ブランドン・T・ペカレック、ベンジャミン・R・アレンキエル

米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学医学科学者トレーニングプログラム

スニグダ・スリヴァスタヴァ、パトリック・J・ハント、ジェイ・M・パテル

米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学神経科学部門

ペイ・シュアン・チン、ジェイ・M・パテル、ベンジャミン・R・アレンキエル

テキサス大学ヒューストン健康科学センター、代謝および変性疾患センター、米国テキサス州ヒューストン

チンチュン・トン

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JLS：概念化、実験計画、実験実施、データ収集、データ分析、原稿執筆・編集、図作成。 JOG: 指導と実践的なトレーニング、概念化、実験計画、実験の実施。 SS：データ収集、データ分析、図作成。 PC：データ収集、データ分析、図作成、原稿編集。 SWD: 実験を実施し、データを収集し、データを分析します。 EHM：実験の実施、データ収集、データ分析、原稿編集。 MYK：実験の実施、データの収集、データの分析。 PJH：実験、データ収集、データ分析、原稿編集、図作成などを行います。 JMP: 概念化、指導、実験計画、原稿編集。 BTP: 指導、データ分析、原稿編集。 QT: 概念化、指導、原稿編集。 BRA: 指導、概念化、実験計画、原稿編集。

ベンジャミン R. アレンキエルへの通信。

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Swanson, JL、Ortiz-Guzman, J.、Srivastava, S. 他前脳基底部から側手綱核までの回路の活性化は、反射的な嫌悪感を引き起こし、摂食行動を抑制します。 Sci Rep 12、22044 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26306-8

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受信日: 2022 年 8 月 24 日

受理日: 2022 年 12 月 13 日

公開日: 2022 年 12 月 21 日

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