再プログラムされたバクテリオファージによる抗生物質レジストームの特性評価

Nature Microbiology volume 8、pages 410–423 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

機能的メタゲノミクスは、環境中の抗生物質耐性遺伝子 (ARG) を同定するための強力な実験ツールですが、適切な宿主細菌種の範囲は限られています。この制限は、特定された ARG の範囲とその臨床的関連性の解釈の両方に影響します。ここでは、Reprogrammed Bacteriophage Particle Assisted Multi-species Functional Metagenomics (DEEPMINE) と呼ばれる機能的メタゲノミクスパイプラインを紹介します。このアプローチは、交換された尾繊維と標的突然変異誘発を備えた T7 バクテリオファージの使用を組み合わせて改善し、ファージの宿主特異性と機能的メタゲノミクスの効率を拡張します。これらの修飾ファージ粒子は、臨床的に関連する細菌性病原体に大規模なメタゲノムプラスミドライブラリーを導入するために使用されました。土壌および腸内マイクロバイオームおよび臨床ゲノム中のARGを13種類の抗生物質に対してスクリーニングすることにより、このアプローチが同定されたARGのリストを大幅に拡大することを実証しました。多くの ARG は耐性に対して種特異的な影響を及ぼします。それらは、ある細菌種では高レベルの耐性を提供しますが、関連種では非常に限られた耐性しか得られません。最後に、現在臨床開発中または最近承認された抗生物質に対するモバイル ARG を特定しました。全体として、DEEPMINE は微生物群集を研究するための機能的メタゲノミクスツールボックスを拡張します。

メタゲノミクスにより、実験室条件では培養できない種を含む微生物群集の徹底的な分析が可能になります。環境サンプルからゲノムデータを抽出することにより、研究者は、さまざまな自然環境におけるマイクロバイオームの種構成と機能に関する知識を得ることができます1。特に、機能的メタゲノミクスは、特定の分子機能をコードする遺伝子の存在についてメタゲノム DNA をスクリーニングすることに専念しています 2,3,4。細菌宿主内で断片化されたメタゲノム DNA をクローニングして発現させると、これまで記載されていなかったタンパク質が明らかになります。機能的メタゲノミクスの応用には、酵素の同定、生理活性物質の探索、環境に存在する抗生物質耐性遺伝子のスクリーニングなどが含まれます5、6、7、8。通常、ライブラリには数百万の DNA フラグメントが含まれており、これは総カバー範囲 5 ～ 100 Gb、数千の細菌ゲノムのサイズに相当します 7、9、10。

機能的メタゲノミクスはいくつかの研究分野に役立つ可能性がありますが、現在の形式では方法論は完璧には程遠く、その適用性は限られています。プラスミドライブラリーのサイズが膨大であることを考えると、これらのライブラリーを細菌宿主に効率的に導入することが最も重要です。しかし、このプロセス（通常はエレクトロポレーション、コンジュゲーション、または従来のバクテリオファージ形質導入による）は面倒であり、限られた範囲の実験室株に対してのみ有効です11、12。この制限は、機能的メタゲノムスクリーニングの適用可能性と導き出される結論の一般性に広範な影響を及ぼします 13,14。例えば、特定の細菌種のみで機能するバイオテクノロジーまたは臨床的に関連する遺伝子のスクリーニングを妨げます 12、15、16。特に、抗生物質耐性遺伝子 (ARG) のほとんどのメタゲノムスクリーニングは、細菌宿主として実験室用大腸菌株の使用に大きく依存しています 5、17、18。したがって、これらの菌株では耐性を示さないが、他の臨床的に関連する病原体では耐性を示す ARG は、依然として検出できないままです。実際、これまでの研究では、抗生物質耐性変異が耐性表現型に及ぼす影響は、細菌宿主の遺伝的背景に依存することが示されています 19。さらに、複数の宿主細菌におけるメタゲノムスクリーニングは、ARG の種間の機能的互換性と可動性に関する貴重な情報を提供する可能性があります 20。

この論文では、これらの問題の解決策を提供する再プログラムされたバクテリオファージ粒子支援多種機能メタゲノミクス (DEEPMINE) を紹介します (図 1a)。 DEEPMINE は、異なる種類のバクテリオファージ間で尾部を交換することにより、DNA 形質導入のための T7 ファージ粒子の宿主範囲を拡張することを目的とした以前の研究に基づいています 21。 DEEPMINE は、このような修飾されたバクテリオファージ形質導入粒子を使用して、大規模なメタゲノムプラスミドライブラリーをさまざまな細菌種に送達します。さらに、我々は、このようなライブラリー配信の効率を高めるために、実験室の方向性進化を適用しました22。このアプローチを使用して、腸内細菌科の臨床的に関連する細菌性病原体でメタゲノムスクリーニングを実行しました。私たちは、抗生物質感受性に種特異的な影響を与える、これまで報告されていないいくつかの ARG を特定しました。さらに、私たちは最近臨床使用が承認された、または臨床開発の後期段階にある一連の抗生物質を研究し、これらの新しい抗生物質は数十年臨床使用された後の古い抗生物質と同様に耐性を形成しやすいことを示しました（拡張データ）表1）。

a、DEEPMINE の概略図。 DEEPMINE は、ハイブリッド T7 バクテリオファージ形質導入粒子と指向性進化を利用して、標的の臨床株における機能的メタゲノミクスのファージ宿主特異性と効率を変更します。次に、メタゲノムプラスミドライブラリーの形で環境 DNA がこれらのバクテリオファージ粒子にパッケージされ、目的の宿主に形質導入されます。スクリーニングヒットの比較分析は、デュアルバーコード付き PCR フリー DNA フラグメントシーケンスパイプラインによって可能になります。 b、特定のハイブリッド T7 バクテリオファージ粒子による機能的メタゲノムライブラリーの形質導入は、少なくともエレクトロポレーションと同じくらい効率的です (大腸菌へのエレクトロポレーションと肺炎桿菌への形質導入 P = 0.010545、2 サンプルの片側 t 検定、n = 3 生物学的に独立)実験;大腸菌へのエレクトロポレーションと大腸菌への形質導入 P = 0.15、2サンプルの片側t検定、n = 3の生物学的に独立した実験;補足表2)。平均±sem c、d、エレクトロポレーションおよび形質導入直後のPCRフリーのロングリードディープシークエンシングを使用して決定された、送達されたメタゲノムDNA断片の長さ（c）および多様性（d）（方法）。破線は DNA 断片の平均サイズを表します。シャノンアルファ多様性指数 (H) は、ライブラリ内の同一配列を持つフラグメントの頻度に基づいて計算されました (方法、大腸菌、肺炎桿菌、および腸球菌については、n = 276,899、n = 188,317、および n = 180,497 を参照) 、それぞれ;補足表3)。提供されたライブラリの一部のみが配列決定されたことに注意してください。

我々はまず、尾部タンパク質が交換されたハイブリッド T7 バクテリオファージ粒子が、機能的なメタゲノムプラスミドライブラリーを細菌培養物に送達するための適切なツールであるかどうかをテストしました。簡単に言うと、我々は環境および臨床レジストーム 23 を取得するためにメタゲノムライブラリーを作成しました。これには、(1) インドの抗生物質生産工場のすぐ近くにある抗生物質で汚染された 7 つの工業用地からの河川堆積物および土壌サンプル (つまり、人為起源の土壌マイクロバイオーム) 24,25 が含まれます。 (2) サンプル提供前少なくとも 1 年間抗生物質を摂取しなかった 10 人のヨーロッパ人からの糞便サンプル (つまり、腸内マイクロバイオーム)、および (3) 医療施設で分離された 68 個の多剤耐性細菌のプールからのサンプルまたは株コレクションから得られます（つまり、臨床マイクロバイオーム。方法、図1aおよび補足表1を参照）。

サイズが 1.5 ～ 5 kb の DNA 断片を、ガンマプロテオバクテリアクラスの選択された順序で複製できる低コピークローニングプラスミドにショットガンクローン化しました 26 (方法を参照)。プラスミド DNA は、T7 ゲノムとは独立してプラスミドを T7 バクテリオファージに転座させるパッケージングシグナル配列を持っています (図 1a)。構築された各ライブラリには 300 ～ 500 万の DNA フラグメントが含まれており、これは合計 25 Gb (つまり、約 5,000 個の細菌ゲノムのサイズ) のカバー範囲に相当します。得られたプラスミドライブラリーは、サルモネラファージ ΦSG-JL2 およびクレブシエラファージ K1121 からの尾繊維タンパク質を表示する、事前に特性評価された 2 つのハイブリッド T7 ファージ粒子にパッケージ化されました。 3 つのメタゲノムライブラリーを Salmonella enterica subsp. に形質導入しました。 enterica血清型ネズミチフス菌str. LT2 および K. pneumoniae NCTC 9131、どちらもこれら 2 つのハイブリッド T7 バクテリオファージ粒子の細菌標的として知られています 21。並行して、モデル細菌大腸菌 K12 のライブラリーをエレクトロポレーションしました (方法)。最後に、T7 ファージ粒子による形質導入がライブラリーのサイズと組成にバイアスを導入するかどうかを分析しました (方法)。

驚くべきことに、ΦSG-JL2およびK11尾部表示ハイブリッドT7バクテリオファージ粒子は、エレクトロポレーションが実験室用大腸菌モデル株に行うのと少なくとも同じ効率で、プラスミドライブラリを標的細菌株に送達しました（図1bおよび補足表2）。特に、宿主細菌に送達されるプラスミドの最大数は、エレクトロポレーションよりも形質導入の方が少なくとも2桁多かった(拡張データ図1aおよび補足表2)。

さらに、ロングリードディープシーケンシングは、T7ファージ粒子によって送達されたライブラリの平均DNA断片サイズと断片多様性の両方が、エレクトロポレーションによって大腸菌に送達されたライブラリのものと同等であることを示しています（図1c、dおよび補足表） 3)。これは、再プログラムされたバクテリオファージ粒子による形質導入が、送達されたメタゲノムライブラリーのサイズと多様性に重大な歪曲効果を及ぼさないことを示しています。最後に、ファージ形質導入後に 38 個の単離された個々の細菌クローンのプラスミド内容を配列決定しました。安心できることに、同じ細胞への 2 つのプラスミドの同時形質導入 (スクリーニングキャンペーンでヒッチハイカーの偽陽性を引き起こす現象) は細胞の 5% のみで検出されましたが、エレクトロポレーションによる同じ細胞への 2 つのプラスミドの同時形質導入は細胞の 10% で発生しました (拡張データ図 1b)。全体として、これらの結果は、交換された尾繊維を有する特定の T7 形質導入バクテリオファージ粒子が機能的メタゲノミクスに適した送達媒体であることを示しています。

私たちの次の目標は、追加の細菌性病原体種の関与に対するアプローチを一般化することでした。ほとんどのハイブリッドファージ粒子の形質導入効率は、機能的メタゲノムライブラリー全体を標的細菌細胞に送達するのに必要な閾値（1 ml あたり >107 個の形質導入体）を大幅に下回っています 21。さらに、そのようなライブラリーの送達には、高濃度の形質導入ファージ粒子の使用が必要である。このような場合、形質導入バクテリオファージ粒子生成の一般的な問題である複製ファージ汚染 27 により、標的細胞の大部分が死滅します (拡張データ図 1c)。

これら 2 つの問題を克服するために、我々は、T7 ファージ粒子の尾部繊維領域を遺伝的に改変するための指向性進化実験を設定しました。具体的には、宿主特異性を変化させるファージ尾部繊維の宿主範囲決定領域 (HRDR) における点突然変異を選択することを目的としました 28,29。この目的を達成するために、我々はまず、特に広い宿主範囲を持つ 3 つの尾部繊維 (エシェリヒアファージ T7、サルモネラファージ ΦSG-JL2、およびサルモネラファージ Vi06) を選択しました 21。次に、サルモネラファージΦSG-JL2の尾繊維遺伝子gp17およびサルモネラファージVi06のvi06_43における潜在的なHRDRを同定した。同定は、よく特徴付けられている T7 および T3 ファージ尾繊維遺伝子 gp17 の受容体結合ドメイン (RBD) 内の 4 つの HRDR に対する配列相同性に基づいていました (方法および補足表 4)28,29。次に、DIvERGEと呼ばれる高頻度の部位特異的突然変異誘発法を使用して、ΦSG-JL2、Vi06、およびT7ファージに由来する尾繊維遺伝子のHRDR内およびその近傍にランダムに分布した突然変異を導入しました（図2aおよび方法）22。他の突然変異誘発プロトコルと比較して、DIvERGE には複数の DNA 部位に沿ってランダムな突然変異を同時に導入できるという利点があり、予測される HRDR を超える可能性がある比較的長い DNA セグメントをカバーできます 22。

a. 以下のステップからなる指向進化実験の概略図。 (1) DIvERGE を使用した大腸菌でのファージテールの突然変異誘発。 DIvERGE は、ソフトランダム化された一本鎖 (ss) DNA オリゴヌクレオチドを複数の標的部位に組み込む組換え技術です (方法)。ファージテールはパッケージ可能なプラスミド上にコードされています。（２）尾部遺伝子を欠くＴ７（Ｔ７Δ（ｇｐ１１－１２－１７））を大腸菌に感染させる。このステップにより、それぞれ同族の変異ファージテールをコードするプラスミドを含む変異ファージ粒子が生成されます。 (3) 選択された標的細胞 (1 ～ 3) に DNA を効率的に注入するファージテールバリアントの選択。選択圧は、抗生物質選択マーカーがプラスミド上にコードされている抗生物質によって作用します。 b、親WT尾部と比較した、最も効率的な変異体尾部繊維の形質導入効率(tfu ml-1)。標的細胞は、Enterobacter cloacae ATCC 23355、Shigella Sonnei HNCMB 25021、E. coli NCTC 13351、およびファージ耐性大腸菌モデル株 (BW25113ΔtrxAΔwaaR) です。平均値 ± 標準誤差 (n = 3 の生物学的に独立した実験)。データは補足表 4 にあります。

次に、形質導入最適化プロトコル 21 を使用して、3 つの病原性細菌種の代表である Enterobacter cloacae ATCC 23355、Shigella Sonnei HNCMB 25021 および E. coli NCTC 13351 にプラスミドライブラリーを送達する能力が向上したファージテール変異体を選択しました（方法、図 2b および補足表4)。同時に、ポジティブコントロールとして、T7様ファージの細胞壁に埋め込まれたリポ多糖受容体が欠損しているファージ耐性大腸菌モデル株（BW25113ΔtrxAΔwaaR）の存在下で、同じプロトコルでT7ファージテールライブラリーを選択しました30,31。

指向性進化の結果、試験した 3 つの病原性細菌株すべてで DNA 形質導入効率が 1 ～ 7 桁向上しました (図 2b)。 Shigella Sonnei HNCMB 25021 を使用すると、形質導入効率はメタゲノムプラスミドライブラリー全体の送達に適したレベルに達しました (図 2b)。ポジティブコントロール ΔwaaR モデル株の場合、最も効率的な変異体 T7 gp17 HRDR は特定の変異の組み合わせを持ち、その 28% は適応変異として以前に報告されています (拡張データ図 2a-c)。全体として、適応変異は形質導入効率を増加させ（図2b、拡張データ図2dおよび補足表4）、少なくとも1つのケース（Shigella Sonnei HNCMB 25021を含むT7 gp17V544G（図2bのMut1））では、形質導入効率も最小限に抑えました。複製ファージ汚染 (説明については、拡張データ図 3 および補足表 5 を参照)。安心できることに、この T7 ファージ尾部変異体による 3 つのメタゲノムライブラリーの Shigella Sonnei HNCMB 25021 への形質導入により、大腸菌 K12 株のエレクトロポレーションによって達成されるライブラリーと同じくらい大きくて多様な機能的なメタゲノムライブラリーが得られました (拡張データ図 4)。および補足表 2 および 3)。全体として、我々は、エレクトロポレーションによる同じライブラリーの送達と比較して、ファージテールの指向性進化により、これまで未開発の細菌株へのメタゲノムライブラリーの送達が改善されることを発見した。

私たちの次の目標は、複数の細菌宿主における機能的メタゲノミクスを通じて細菌抗生物質レジストームのサンプリングを改善することでした。この目的を達成するために、本発明者らは、上記の３つのメタゲノムライブラリー（土壌、腸、臨床）を３つの病原性細菌宿主（サルモネラ・エンテリカＬＴ２、肺炎桿菌ＮＣＴＣ９１３１およびシゲラ・ソンネイＨＮＣＭＢ２５０２１）および大腸菌ＢＷ２５１１３においてスクリーニングした。スクリーニングは、野生型 (WT) 宿主株が感受性のある濃度で、5 つの主要な抗生物質クラス (拡張データ表 1) をカバーする 13 種類の選択された抗生物質の 1 つの存在下で固体寒天上で実施されました。このリストには、長い臨床歴（「古い」）を持つ 6 つの抗生物質（ドキシサイクリン（DOX）、ゲンタマイシン（GEN）、セフジニル（CFD）、セフォキシチン（CEF）、メロペネム（MER）およびモキシフロキサシン（MOX））と、その他の 7 つが含まれています（エラバサイクリン (ERA)、オマダサイクリン (OMA)、硫酸アプラマイシン (APS)、セフトビプロール (CEF)、スロペネム (SUL)、デラフロキサシン (DEL) およびゲポチダシン (GEP)) 最近 (2017 年以降) クリニックに導入された、または現在導入されている現在臨床開発中です (「最近」、2020 年 4 月時点、拡張データ表 1)。 CEF32を含む研究されたすべての抗生物質は、グラム陰性病原体に対する活性を実証しています。注目すべきことに、APS は獣医学で 10 年以上使用されてきましたが、現在、ヒトの全身性グラム陰性感染症を治療する臨床試験中です 33。

得られた耐性付与プラスミドをプールし、改良型デュアルバーコードショットガン発現ライブラリー配列決定パイプラインを用いて配列決定した（拡張データ図５および方法；参考文献３４も参照）。このプロトコルでは、耐性を付与する DNA 断片の PCR 増幅が回避されるため、サンプルの元の組成が保存されます。得られた DNA 配列を関連データベース 35,36 の抗生物質耐性遺伝子と並べることにより、571 個のフラグメントの 84% が既知の耐性遺伝子との十分な配列類似性 (方法) を示すことがわかりました (補足表 6)。検出された ARG の多くはいくつかの異なる DNA フラグメント上で分離されていたため、データセット内の配列の冗長性を減らすために、ARG は 95% の同一性とカバー率でクラスター化されました 37。パイプラインの再現性を定量化するために、肺炎桿菌を使用して完全なプロトコル (1 回のライブラリー配信、スクリーニング、およびシーケンス) を繰り返しました。安心できることに、ARG の 83.3% が両方の生物学的複製で分離されました (図 3a)。

a. パイプラインの再現性。ベン図は、肺炎桿菌を用いた 2 つの生物学的反復スクリーニングで検出された ARG の数を示しています。交差部分は両方の反復で分離された ARG を表し、83% の再現性に相当します (補足表 6)。 b、大腸菌および残りの宿主種を使用して単離されたARGの数を示すベン図。大腸菌を唯一の宿主として使用した場合、合計 114 個の ARG のうち 43% が未検出のままでした (補足表 6)。 c、4 つの宿主種を使用して同定された ARG の遺伝子ファミリーを示すヒートマップ。カラーコードは、遺伝子ファミリーに属する特定された ARG の数を定量化します (補足表 7)。 d、使用した3つのレジストームにわたる4つの宿主で特定されたARGの数（補足表6）。 e, 複数および単一のコンティグ上に存在する可動性 ARG (遺伝子の水平伝達への関与の検出を示すために HGT として示される) および非可動性 (遺伝子の水平伝達への関与の欠如を示すために非 HGT として示される) ARG の数。メタゲノムライブラリー (両側フィッシャーの直接確率検定、P = 1.058 × 10−5、n = 114、補足表 6)。

合計 114 個の ARG が検出され、その多くは複数の DNA 断片に存在していました (補足表 6 および 7)。この分析では、調べた 4 つの宿主細菌種間で同定された ARG レパートリーに大きな違いがあることも明らかになりました。特に、分析を細菌宿主として大腸菌に限定した場合、合計 114 個の ARG のうち 43% が未検出のままでした（図 3b ～ d および拡張データ図 6）。これは、DEEPMINE が複数の宿主細菌を利用することにより、細菌レジスタームのより包括的なサンプリングを可能にすることを示しています。排出ポンプ、それらに対応する転写調節因子、および抗生物質不活化酵素は、検出されたARGに共通でした（図3cおよび拡張データ図7a）。腸、土壌および臨床マイクロバイオームから単離されたARGのかなりの部分はプロテオバクテリアに由来しており、プロテオバクテリアは我々のスクリーニングにおける宿主細菌種と系統発生的に近縁である(拡張データ図7b)。

次に、スクリーニングで検出された ARG が自然界で水平遺伝子伝達を起こしやすいかどうかを判断しました。過去に人間が関係する環境で動員された ARG は、人間の病原体に蔓延する可能性があるため、より高い健康被害を引き起こす可能性があります 38。この問題を調査するために、我々は、遠縁の細菌ゲノムに共有されるほぼ同一の遺伝子の同定に基づいてモバイル遺伝子カタログを作成しました 37,39,40。具体的には、系統発生的に多様なヒト関連細菌種の 2,794 ゲノムのペアワイズアラインメントを実行しました (補足表 8)。このデータセットは、さまざまな環境に由来する 27,939 個の天然プラスミドの配列データベースで拡張されました (参考文献 41、方法)。プラスミドによって運ばれる ARG は細菌種間で移動する可能性が特に高く、移動性 ARG に関する 2 つのデータセット間で 91% の一致がありました (補足表 7)。注目すべきことに、私たちのスクリーニングで複数のDNA断片に存在するARGは、単一のDNA断片にのみ存在するARGと比較して、自然界でより頻繁に水平遺伝子伝達を受けました（図3e）。

次に、4 つの細菌宿主間で検出された ARG レパートリーの変動がどのように説明できるかを尋ねました。最初の仮説は、確率的なプラスミド損失により、特定の ARG が検出されないままになるというものでした。これは、メタゲノムライブラリの新しい宿主への形質導入中、またはスクリーニングプロセス中に発生する可能性があります。あるいは、移入された ARG は、すべての細菌宿主の生理機能と機能的に適合しない可能性があります 20。したがって、いくつかの ARG は特定の細菌種にのみ耐性をもたらします。最初の仮説は確かに関連性がありますが、いくつかの証拠は細菌種間で ARG の耐性表現型に大きな違いがあることを示しています。

これらの仮説を検証するために、我々はまず、大腸菌に抗生物質耐性をもたらす DNA 断片が他の 3 つの宿主細菌種の抗生物質感受性をどのように形作るかを調べました。私たちは、細菌宿主全体に提供される抗生物質耐性のレベルを測定することにより、スクリーニングから得られた 13 個の耐性を付与する DNA フラグメントの代表的なセットを分析しました。特定のARGが複数の抗生物質スクリーニングで検出されたため、合計20の抗生物質とDNA断片の組み合わせを研究しました（図4a）。研究した20例のうち7例では、DNA断片は他の3種の細菌種のうち少なくとも1種の耐性レベルに変化をもたらさなかった(最小発育阻止濃度(MIC)の2倍の変化をカットオフとして使用)。したがって、平均して、大腸菌と他の 3 種のペアの間で重複する機能的 ARG は 80% のみでした。さらに、特定の DNA フラグメントによってもたらされる耐性レベルに最大 256 倍の実質的な変動が観察されました (図 4a および補足表 9)。排出ポンプ、転写調節タンパク質、および抗生物質修飾酵素は同様に、研究した細菌種全体で耐性レベルにこのような大きな変動を示しました（図4a）。

a、4 つの宿主種における 13 の耐性を与える DNA フラグメントによってもたらされる耐性レベルの実質的な変動を示すヒートマップ。カラーコードはMIC倍数の変化を定量化します。白色は、MIC の 2 倍の変化をカットオフとして使用し、抵抗レベルが変化しないことを意味します。データは補足表 9 で入手できます。b、測定ノイズを制御した後の宿主種のペア間の機能的 ARG セットの重複を表す調整された Jaccard 類似度係数 (方法と拡張データ図 8 を参照)。括弧内の数字は 95% 信頼区間 (方法) を表します。

最後に、メタゲノムスクリーニングで検出されたすべての耐性を付与する DNA 断片を再調査しました。対応するプラスミドをプールし、得られた事前に選択されたプラスミドライブラリを 4 つの天然細菌宿主種のそれぞれに再導入しました。続いて、前述のように、固体寒天上でこのライブラリを使用して新しい抗生物質選択スクリーニングを実行しました。形質導入中の確率的プラスミド損失を制御するために、抗生物質による選択の前後に新しいプラスミドライブラリーの配列を決定しました。 ARG のうち、70% (114 個中 80 個) は、形質導入後、抗生物質選択前に、4 つの細菌宿主種すべてにおいて少なくとも 1 つのプラスミドによって表されました (補足表 10)。抗生物質の選択後、これらの ARG のうち 63 個が、4 つの細菌宿主種のうちの少なくとも 1 つで抗菌活性を示すことが検出されました (補足表 10)。注目すべきことに、抗生物質選択中に失われた17個のARGのうち16個は、単一の耐性を付与するDNA断片のみによってコードされていた(拡張データ図8a)。スクリーニングの精度で重複を調整した後（拡張データ図8b）、平均して、ARGの70％が種のペア間で重複しました（図4bおよび拡張データ図8c）。合計すると、ARG の約 46% (63 個中約 29 個) のみが、4 つの細菌宿主種すべてで耐性を示しました (拡張データ図 8d)。明らかに、より大規模なメタゲノムデータセットに関する今後の研究により、ARG の種特異性プロファイルを形作る正確な生化学的、細胞的および系統学的特徴が明らかになるはずです。

まとめると、これらの結果は、ARG が新しい細菌宿主に移入されると、抗生物質感受性に種特異的な影響を与えることが多いことを示しています。

次に、「最近の」抗生物質が「古い」抗生物質と比較してどれだけ ARG 動員を受けやすいかを推定しました。我々は、考慮したマイクロバイオームに関係なく、ARG の総数が 2 つの抗生物質グループで統計的に同じであることを発見しました (図 5a、表 1)。(拡張データ図 9a)。さらに、分析が水平遺伝子伝達事象が確立されたARGに限定された場合でも、上記の結果は残りました（図5bおよび拡張データ図9b）。予想通り、同じ薬物クラスに属する「古い」抗生物質と「最近の」抗生物質の間では耐性機構がほぼ重複しており（図5c）、交差耐性が蔓延している可能性があることを示唆しています。最近、院内および市中肺炎の治療薬として承認された第 5 世代セファロスポリンである CEF は、この点を強調しています 42,43。 ARG (例: β-ラクタマーゼ) の全体的な頻度と移動性 ARG の頻度はどちらも、数十年臨床で使用されている「古い」β-ラクタム系抗生物質の頻度と比較しても、CEF に対して例外的に高かった (表 1)。 .5a–c)。実際、拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ（ESBL）は一般にセフトビプロールを加水分解する44ため、そのようなESBLを産生するグラム陰性多剤耐性病原体に対する臨床的有用性は限られています45。

a、ARG の総数は、「最近の」抗生物質と「古い」抗生物質で統計的に同じです（両側ウィルコクソン順位和検定、P = 0.8051、「古い」の n = 107、「最近」の n = 114。補足表7)。 b、同じことが、水平遺伝子伝達事象が確立されたARGにも当てはまります（P = 0.6106、両側ウィルコクソン順位和検定、「古い」抗生物質と「最近の」抗生物質についてそれぞれn = 27と23;補足表7）。 c. 耐性メカニズムは、同じ薬物クラスに属する「古い」抗生物質と「最近の」抗生物質の間でほぼ重複しています。ヒートマップは、ARG プロファイルに基づいた抗生物質のクラスタリングを示します。色分けは、メカニズムごとにグループ化された検出された ARG の数を定量化します。データは補足表 7 に記載されています。

この傾向の注目すべき例外は、ヒトへの適用を目的として臨床試験中の抗生物質である APS です。この抗生物質に対して腸管レジストームでは 1 つの ARG のみが検出され、臨床分離株のプールされたコレクションでは検出されませんでした (補足表 7)。しかし、数十年にわたる獣医学におけるAPSの広範な使用と一致して、APSに対する複数のARGが土壌マイクロバイオームで検出されました（図5c）。同定されたARGの大部分は、複数の病原性宿主において機能的に適合するアミノグリコシドアセチルトランスフェラーゼである（表1、補足表7および図5c）。これは、これらの遺伝子が将来的に臨床リスクを引き起こす可能性があることを示唆しています。この予想と一致して、これらのアミノグリコシドアセチルトランスフェラーゼの 1 つである AAC(3)-IV は、APS 耐性の臨床細菌ですでに検出されています 46。全体として、DEEPMINE は、現在、健康に影響を与える可能性のある非ヒト関連マイクロバイオームでのみ検出可能な ARG を予測するための有用なツールである可能性があります。

この研究では、機能的メタゲノミクスに適用できる宿主細菌種の範囲を広げるアプローチである DEEPMINE を紹介します。以前の研究では、大腸菌ファージ T7 の尾部繊維を交換するか、T7 尾部繊維をコードする遺伝子にランダムな変異を生成することによって、バクテリオファージの宿主範囲を拡大できることが示されています 21。 DEEPMINE は、尾部繊維が交換および/または変異誘発された再プログラムされたバクテリオファージ形質導入粒子を使用して、大規模なメタゲノムプラスミドライブラリーをさまざまな細菌種に送達します (図 1)。エレクトロポレーションやコンジュゲーションなどの機能的メタゲノミクスのための既存の技術に対する DEEPMINE の主な利点は、効率が高いことです。特に、DEEPMINE はエレクトロポレーションよりも、小さなインサート (1.5 kb ～ 5 kb) メタゲノムプラスミドライブラリーを選択した細菌宿主に導入するのに適していることがわかりました (図 1 および拡張データ図 1)4,47。コンジュゲーションは、通常 104 ～ 105 クローンを含む大きなインサートサイズ (10 kb ～ 40 kb) のライブラリを送達するために頻繁に使用されますが、この技術で 106 ～ 107 を超えるトランスコンジュガントを取得することは非常に困難です 48,49。一方、この研究で使用したような小さなインサート (1.5 kb ～ 5 kb) のメタゲノムライブラリでは、通常、十分な範囲をカバーするライブラリを提供するために 108 以上のプラスミドが必要です。

私たちのアプローチを使用して、13 種類の抗生物質、3 つのメタゲノムライブラリー (土壌、腸内および臨床マイクロバイオームから分離)、および 4 つの関連する腸内細菌科種のすべての可能な組み合わせを使用して、156 件のメタゲノミクススクリーニングを実行しました。我々は、複数の宿主種を研究することにより、細菌のレジストームが大幅に拡張されることを実証します。単一種 (大腸菌) のみを考慮した場合、重複しない ARG の 43% は検出されないままです (図 3)。したがって、DEEPMINE により、特定の臨床的に関連する病原体のみに耐性を与える ARG の同定が可能になります。実際、我々は、将来の健康リスクとなる可能性のある、最近開発された抗生物質に対する多数の ARG を特定しました (図 5)。これらの結果に基づいて、DEEPMINE は一般的な関心が高まっている ARG の将来の普及を予測する有用なツールになると予想されます 6,16,37,38,50。ただし、DEEPMINE の現在の制限は、目的の宿主細菌を機能的メタゲノミクスに使用できるように適切なファージ粒子を操作するには、かなりの時間とリソースが必要であることです。

要約すると、私たちの研究は、可動抵抗体を形成する力についてのより深い洞察を提供します。今後の研究では、検出された ARG の移動性と機能的適合性をより包括的な方法で分類し、より広範囲の臨床分離株で検査するために関連するメタゲノムライブラリーを拡張する必要があります。

この研究は、セゲド大学アルバート・セント・ジェルジ臨床センターの人体調査審査委員会およびインド国立生物多様性局（NBA）によって承認されたすべての関連倫理規制に準拠しています。糞便サンプル収集の許可は、セゲド大学アルバート・セント・ジェルジ臨床センターの人体調査審査委員会（72/2019-SZTEに登録）から得ました。ボランティア参加者は、(1) サンプル提供前の少なくとも 1 年間は抗生物質を服用していない、(2) 健康状態が良い、という厳格な基準に基づいて選ばれました。これらの要件はこの分野の標準であり、健康なヒトの腸内マイクロバイオームにおける抗生物質レジスタームのバイアスのない比較を保証します。すべての参加者からインフォームドコンセントを得ました。ハイデラバード市とラクナウ市周辺からの土壌と川の堆積物サンプルの収集が、インドの国立生物多様性局 (NBA) によって承認されました (申請番号: NBA/Tech Appl/9/1822/17/18-19/3535)。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されていませんが、サンプルサイズは以前の出版物で報告されたものと同様です18、51、52。サンプルは実験グループに割り当てられませんでした。個々の実験のサンプルは 1 人の担当者が担当しました。データの収集と分析は、実験条件を無視して実行されたわけではありません。分析から除外されたデータはありません。特に明記されていない限り、キットを使用する場合はメーカーの指示に従いました。

T7 形質導入および配列決定パイプラインとの互換性のために、pZE21 発現ベクター (補足表 11) からカスタムプラスミドを作成しました。具体的には、複製起点をColE1からp15Aに切り替え、T7バクテリオファージのパッケージングシグナルを導入しました(使用した酵素とプライマーは補足表11に記載されています)。続いて、pZE21_p15A ベクターを、10 nt 長のランダムバーコード (補足表 11) を含むプライマーの混合物を使用した PCR によって増幅し、続いて消化およびセルフライゲーションを行いました。

腸内マイクロバイオームライブラリーのために、サンプル提供前の 1 年に抗生物質の摂取歴のない血縁関係のない健康な個人 10 人から糞便サンプルを収集しました。人為起源の土壌マイクロバイオームについては、インドの高度に抗生物質に汚染された工業地帯からサンプルが収集されました53。腸および土壌サンプルからのメタゲノム DNA は、DNeasy PowerSoil キット (Qiagen、47016) を使用して抽出されました。臨床細菌分離株のゲノム DNA (補足表 1) は、Sigma GenElute 細菌ゲノム DNA キット (Sigma、NA2110-1KT) を使用して単離されました。

各サンプルから抽出した DNA 40 μg を MluCI 酵素 (NEB、R0538L) で消化し (10 分、37 ℃)、続いて不活化しました (20 分、85 ℃)。 MluCI 酵素の量を変更して、1 ～ 5 kbp のターゲットサイズ範囲の DNA を取得しました。 DNA は、0.75% アガロースゲルカセットおよび低電圧 1 ～ 6 kbp マーカー S1 カセット定義を使用したパルスフィールドゲル電気泳動 (Sage Science、PB02901) で単離されました。メタゲノム DNA 断片を、インサート:ベクターの質量比 3:1 を使用して、EcoRI 部位で pZE21_p15A プラスミドにライゲーションしました。純粋なライゲーション混合物を、大腸菌 MegaX (Invitrogen、C640003) または大腸菌 10G ELITE (Lucigen、60080-2) 細胞 40 μl にエレクトロポレーションしました。 37℃で1時間インキュベートした後、コロニー形成単位を決定するために、形質転換体を101×、102×、および103×希釈でルリア・ベルターニ（LB）寒天プレートを含む50μg ml-1のカナマイシンに播種しました。回収した残りの細胞を、カナマイシンを補充したLB寒天プレート上で一晩増殖させた。翌日、プラスミドを単離した。インサートのサイズ分布は、ランダムに選択された 10 ～ 20 個のクローンからの関連プラスミド領域の PCR 増幅によって推定されました。平均インサートサイズは 2 ～ 3 kbp であることが判明しました。

形質導入ハイブリッドバクテリオファージの調製は、参考文献から適応されました。 21. 簡単に説明すると、ファージテールをコードするプラスミドを含む大腸菌 BW25113 細胞 (補足表 11) を光学密度 (OD)600nm ~0.7 (37 °C で 250 rpm) まで増殖させ、氷上に 15 分間置きました。次に、培養物を遠心分離し（2,200×g、4℃、10分間）、上清を廃棄し、細胞を同量の培地（LBまたはテリフィックブロス（TB））に再懸濁しました。その後、T7 ファイバーコード領域 (T7Δ(gp11-12-17)) を欠く T7 バクテリオファージを使用して、感染多重度 (MOI) 2 ～ 3 で細胞を感染させました。 2 時間のインキュベーション (100 rpm、37 °C) 後、細胞を 2% クロロホルムで処理し、ボルテックスしました。次いで、混合物を上記と同じパラメータで遠心分離した。最後に、ファージ粒子を含む上清を回収した。

形質導入効率は前述のように測定されました21。簡単に説明すると、標的細菌細胞を OD600 ~0.5 (37 °C で 250 rpm) まで増殖させた後、氷上で 15 分間インキュベートし、その間に形質導入ファージ粒子の希釈液を 10 倍希釈段階で調製しました。次に、50 μl の標的細胞を、各希釈液からの 50 μl のファージ粒子と混合しました。プレートを37℃、180rpmで1時間インキュベートしました。次いで、サンプルを抗生物質を供給した寒天プレート上にスポットした。 ml当たりの形質導入体形成単位(tfu ml-1)をコロニー数に基づいて計算した。

ファージテールをコードするプラスミドを含む大腸菌 K12 BW25113 株に、各プラスミドライブラリー 30 ng を 5 回並行してエレクトロポレーションして、適切なコロニー数を達成し、その後、抗生物質を含む LB 寒天プレートにプレーティングし、一晩増殖させました。増殖後、細胞は 20% グリセロール中で -80 °C で保存されました。次に、ライブラリーを含む凍結細胞を、カナマイシン 50 およびストレプトマイシン 100 を補充した 40 ml LB 中で、OD600 が 0.7 になるまで 37 ℃、230 rpm で振盪することによって増殖させた。細胞を氷上で冷却し、2,000 × g (4 °C、10 分間) で遠心分離し、LB 培地に再懸濁しました。次に、T7Δ(gp11-12-17) バクテリオファージを使用して MOI 2 ～ 3 で細胞を感染させました。 2 時間のインキュベーション (37 °C で 100 rpm) 後、細胞を 2% クロロホルムで処理し、ボルテックスしました。次いで、混合物を遠心分離し、上清を収集した。

対応する細菌株の一晩培養物を50 ml LB培地でOD600 0.1まで希釈し、230 rpm、37℃でOD600 0.5まで増殖させた。次に、形質導入粒子を含むライブラリー 20 ml を細胞に添加し、続いて同じパラメーターで 1 時間インキュベートしました。次に、細胞を 2,200 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、1 ～ 5 ml LB 培地に再懸濁し、LB + カナマイシン 50 上にプレーティングし、一晩増殖させました。翌日、細胞を収集し、グリセロールとともに-80 °Cで保存しました。各ライブラリーの 50 ng を 5 回並行して大腸菌 K12 BW25113 にエレクトロポレーションしました。細胞をSOC培地中で37℃で1時間回収し、LB + kanamycin50プレートにプレーティングし、一晩増殖させた。翌日、細胞を収集し、20% グリセロール中で -80 °C で保存しました。

尾繊維遺伝子の HRDR を特定するために、最近同定された T3 コリファージ 29 の gp17 の HRDR を、エシェリヒアファージ T7 gp17、サルモネラファージ ΦSG-JL2 gp17 およびサルモネラファージ Vi06 gp43 の尾繊維配列とアラインメントしたペアワイズ配列アライメントを使用しました。。次に、決定された部位と近位領域に、90 mer オリゴを含む突然変異負荷の標的組み込みに基づく技術である DIvERGE22 による標的突然変異誘発を施しました。簡単に説明すると、変異するファージテールをコードするプラスミドと変異誘発を媒介するプラスミドを保有する大腸菌 BW25113 細胞 22 を、適切な抗生物質を供給した TB (37 °C で 250 rpm) で約 OD600 0.3 ～ 0.4 まで増殖させました。次に、遺伝子発現を誘導するために m-トルイル酸を添加し (最終濃度 1 mM)、1 時間インキュベートした後、細胞を氷に移して 15 分間放置しました。細胞培養物は、洗浄と遠心分離（2,200 × g、4 °C、10 分、3 回）を繰り返してエレクトロコンピテントにし、その後 2.5 μM オリゴでエレクトロポレーションしました（補足表 11）。 TB (250 rpm、37 °C、1 時間) での回収後、細胞を適切な抗生物質を加えた 19 ml TB に移し、一晩放置して増殖させました。必要と思われる場合には、突然変異誘発サイクルを繰り返しました。

送達能力が向上した尾部変異体を選択するために、形質導入最適化プロトコルを適用しました。簡単に言うと、最初の弱い T7 バクテリオファージ感染力に基づいて、3 つの病原性細菌株 (Enterobacter cloacae ATCC 23355、Shigella Sonnei HNCMB 25021、および E. coli NCTC 13351) を選択しました。これらの標的細菌細胞をLB中で約OD600 0.5（37℃で250rpm）まで増殖させ、細胞を氷上に15分間置き、2mlのファージ粒子と1：1の体積比で混合し、37℃でインキュベートしました。 ℃、１００ｒｐｍで１時間。次いで、混合物をプレーティングし、37℃に置いて一晩増殖させた。同じプロトコールを、変異誘発されていない野生型ファージ尾部を持つ粒子を用いて実行した。翌日、コロニーをプールし、GeneJET プラスミドミニプレップキット (Thermo Fisher) を使用してプラスミド DNA を単離し、次に DNA Clean and Concentrator-5 (Zymo Research キット、D4004) を使用してさらに精製しました。プラスミドのうち 100 ng を大腸菌 BW25113 細胞にエレクトロポレーションしました。回復後、細胞に適切な抗生物質を供給し、1時間のインキュベーション後に寒天プレート上に広げ、一晩増殖させました。翌日、細胞を4 ml LBにプールし、250 μlを適切な抗生物質を加えた40 ml TBに移し、〜OD600 0.7（37℃で250 rpm）まで増殖させました。増殖後、細胞を氷上に 15 分間置き、遠心分離（2,200 × g、4 °C、10 分間）し、再懸濁しました。次に、細胞培養物を T7Δ(gp11-12-17) バクテリオファージに感染させました。 2 時間後 (37 °C で 100 rpm)、細胞を 2% クロロホルムで処理し、ボルテックスしました。上記パラメータで遠心分離した後、上清中に存在するファージを回収した。調査した細菌株の形質導入は、形質導入細胞数の飽和が観察されるまで繰り返しました (約 2 ラウンドまたは 3 ラウンド)。最後に、単一コロニーからのプラスミドの配列を決定して、尾部の変異を明らかにしました。

MGP4240またはMGP4240_gp17V544GおよびpZE21_p15Aプラスミドを含む大腸菌細胞をT7Δ(gp11-12-17)ファージに感染させて、pZE21_p15Aプラスミドをパッケージ化した。得られたファージ粒子を使用して、MGP4240またはMGP4240_gp17V544Gのいずれかを保有する大腸菌BW25113およびゾンネブドウ球菌HNCMB 25021においてファージ溶解物を生成した。標的細胞内にファージテールをコードするプラスミドが存在することは、複製ファージが汚染されてプラークを形成するために必要であった。プラークアッセイのために、4 ml の上層寒天を調製し、100 μg ml-1 ストレプトマイシン (Sigma、S6501-25G) および 400 μl の一晩培養物を補充しました。最後に、各ファージストックから 10 µl を 1 ～ 1010 倍に希釈して上部寒天上に滴下しました。

機能的なメタゲノムライブラリーの送達では、T7 gp17V544G ファージテールバリアントで同定された変異を、対応する変異を持つプライマーを使用したプラスミド全体の増幅を使用してプラスミド MGP424021 に導入し、続いて DpnI (Thermo Fisher、ER1701) 処理で元のメチル化テンプレートを除去しました。プラスミド DNA、その後のゲル電気泳動、ゲル抽出、セルフライゲーション。次いで、プラスミドを大腸菌BW25113細胞にエレクトロポレーションした。所望の構築物を有する形質転換体をPCRによって同定し、配列決定によって検証した。

耐性に関する機能的選択は、所定の抗生物質の濃度勾配を含むミューラーヒントンブロス（Sigma、90922）寒天プレート上で実施した（参考文献54から改変）。抗生物質は Sigma または MedChem Express から購入しました。プレーティングされた細胞の数は、対応するメタゲノムライブラリーのサイズの少なくとも 10 倍をカバーしました。プレートを37℃で24時間インキュベートした。各機能的選択について、対照プレートは、空のプラスミド（すなわち、マルチクローニング部位にクローン化されたDNA断片を含まないプラスミド）を含む同数の細胞を用いて調製され、これは、クローン化されたDNA断片を含まない細胞に対して抗菌性化合物の阻害ゾーンを示した。あらゆる耐性プラスミド。ライブラリーからの耐性クローンは、対照プレートからの阻害ゾーンと比較して目視検査によって定義されたプレート領域（阻害ゾーンの遠位で、より高い抗生物質濃度を含む）からの散発的コロニーを一緒に洗浄することによって単離された。 LB に懸濁した培養物の半分をプラスミドの単離に使用し (GeneJET プラスミドミニプレップキット、Thermo Fisher、PLN70-1KT)、残りをグリセロールで凍結し、-80 °C で保存しました。

得られた耐性付与プラスミドは、参考文献に基づいてハイブリッド配列決定パイプライン（拡張データ図5）を使用して配列決定されました。 34. ロングリードシークエンシングにより、メタゲノム DNA フラグメント (インサート) と、各メタゲノム DNA フラグメントの上流および下流 (それぞれアップタグおよびダウンタグ) にプレクローン化された 2 つの 10 nt 長のランダムバーコードが特定されます。各スクリーニングから得られたプラスミド DNA 調製物のアリコートを等モル比でプールしました。ラムダエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼ I の二重消化によって混合物からゲノム DNA 汚染を除去しました。得られたサンプルを洗浄し (DNA Clean and Concentrator-5、Zymo Research キット)、定量しました。次に、プラスミド DNA 1 μg ごとに 5 U の SrfI 制限エンドヌクレアーゼ (NEB、R0629S) を加えてプラスミド混合物を直線化し (37 °C で 1 時間、続いて 65 °C で 20 分間不活化)、DNA をOxford Nanopore ロングリードシーケンスに適用する前に、Qubit dsDNA ブロードレンジアッセイキット (Thermo Fisher、Q33266) を使用して定量化しました。並行して多重化されたショートリードディープシーケンシングを各機能的メタゲノムプラスミド DNA 調製物 (以前のプール) に適用して、ナノポアコンティグとスクリーニングサンプルを関連付けました (拡張データ図 5)。この目的を達成するために、イルミナ固有のフォワードおよびリバースプライマーペアを使用して、各選択実験のプラスミド調製物上のアップタグおよびダウンタグバーコードを個別に増幅しました。各プライマーペアには、それぞれ P5 アダプター配列と P7 アダプター配列、および多重化部位とプラスミドアニーリング部位の 8 nt 長のバーコードが含まれていました (補足表 11)。以下の反応混合物を使用して、Phusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ (Thermo Fisher、F530S) を使用して PCR を実行しました: 15 ng のテンプレートプラスミド DNA、4 μl 5× GC バッファー、0.2 μl の Phusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、0.6 μl DMSO (ジメチルスルホキシド）、0.2 mM dNTP、0.5 ～ 0.5 μM のフォワードおよびリバースプライマー、および水を最終容量 20 μl に加えます。次のサーモサイクラー条件を使用しました:95 °C 5 分間、95 °C 30 秒 + 59 °C 30 秒 + 72 °C 5 秒、72 °C 7 分間を 30 サイクル。各 PCR 反応の濃度測定後、サンプルを 1:1 の質量比で混合しました。次に、0.75% アガロースゲルから 137 bp 長のフラグメント混合物を単離しました。

ライブラリーは、1 μg プラスミド DNA を使用してライゲーションシーケンスキット (Oxford Nanopore Technologies、SQK-LSK109) を使用して調製しました。 DNA を NEBNext FFPE Repair (M6630S) および Ultra II End Prep キット (E7546S) でエンドプレップし、Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter、A63882) を使用して精製し、次に NEBNext Quick T4 DNA リガーゼ (E6056S) を使用してアダプターをライゲーションしました。最後に、適応させたライブラリを Agencourt AMPure で精製し、Qubit 3.0 を使用して定量し、ONT ランニングバッファーおよびローディングビーズと混合し、MinION デバイスに取り付けられた FLO-MIN106 9.4.1 SpotON フローセルでプライミングし、72 時間実行しました。高精度の構成設定を備えた Guppy アルゴリズム (v8.25) がベースコールに使用されました。 NanoFilt v2.7.155 を使用して、生のリードを品質値 (QC ≥ 7) と長さ (4,000 ～ 8,000 bp) に基づいてフィルターしました。リードは、minimap2 (v2.17)56 を使用して参照配列にマッピングされました。 SAM ファイルはソートされた BAM に変換されました。挿入配列が抽出され、バーコードが識別され、samtools tview (1.11-9-ga53817f) サブコマンド 57 を適用して読み取り/挿入名に追加されました。個々の FASTQ ファイルは SEQTK (v0.13.2)58 を使用して作成されました。コンセンサス配列は、パラメータ -l 0 -r 0 -g -2 を指定した SPOA (v4.0.2)59 を使用して生成されました。最後に、生のコンセンサスインサートを、minimap2 および racon (v1.4.19)56 による関連するインサート配列セットを使用して磨き上げ、少なくとも 100 倍のカバー率を持つ最終コンセンサスインサートを作成しました。送達されたメタゲノム DNA フラグメントの長さと多様性は、大腸菌 BW25113 へのエレクトロポレーションおよびサルモネラエンテリカ亜種への形質導入の直後にロングリードディープシーケンシングを使用して決定されました。 enterica血清型ネズミチフス菌str. LT2、K. pneumoniae NCTC 9131 および S. Sonnei HNCMB 25021。シャノンアルファ多様性指数 (H) は、ビーガン R パッケージ (2.5-7)60 を使用して、すべての宿主の各コンティグの頻度に基づいて計算されました。

プールしたシーケンシングライブラリを0.1M NaOHで変性し、HT1ハイブリダイゼーションバッファー(Illumina)で12pMに希釈し、40% PhiX Control v3(Illumina)シーケンシングコントロールライブラリと混合した。変性シーケンスプールを MiSeq 試薬キット V2-300 (Illumina) にロードし、適切なカートリッジ位置 (12、12、それぞれ、14 および 13)、最終濃度 0.5 μM。

メタゲノムスクリーニングから収集された耐性プラスミドプールを混合し、4 つの宿主に再形質転換または再エレクトロポレーションしました。選択実験は、前述のように勾配寒天プレート上で実施した(上記の「抗生物質耐性の機能的選択」を参照)。耐性コロニーを収集し、プラスミドの調製後、イルミナシークエンシングによってプラスミドのバーコードを配列しました（補足方法）。種を越えた機能的ARGセット間の重複を計算するために、我々はまず、選択した13個の耐性を付与するDNA断片のMIC測定結果と結果を比較することにより、スクリーニングの精度を推定した。これらの比較に基づいて、スクリーニングの真陽性、偽陽性、真陰性、および偽陰性率を推定しました。次に、次のように画面の精度を考慮して、種のペアごとに調整された Jaccard インデックスを計算しました。種ごとに、検出された耐性インスタンスの存在/不在の元のベクトルを、元の存在 (不在) 値が陽性 (陰性) 的中率 (つまり、割合) と等しい確率でランダムに保持される新しいベクトルに置き換えました。すべての陽性ケースの中の真陽性者の割合、およびすべての陰性ケースの中の真陰性者の割合）。この手順を 50,000 回繰り返し、種のペア間の Jaccard 指数の中央値と 95% 信頼区間を計算しました。

我々は、大腸菌に対する抗生物質耐性を与える DNA 断片が、ソンネイ赤血球 HNCMB 25021、肺炎桿菌 NCTC 9131、およびサルモネラエンテリカ亜種における感受性にどのような影響を与えるかを測定しました。 enterica血清型ネズミチフス菌str. LT2。この目的のために、抗生物質選択スクリーニングで単離された 13 個のプラスミドの代表的なセットを使用しました。各株について、提供された耐性レベル (つまり、MIC) を 96 ウェルプレートでの標準的な 12 ステップの微量希釈法で測定し、MIC 倍数変化を、それらを含む対応する空のベクターの MIC と比較することによって決定しました。緊張をコントロールします。 MIC は、24 時間のインキュベーション (37 °C、180 rpm) 後の細胞増殖 (OD600) に基づいて決定されました。

ナノポアシーケンシングからの各コンセンサス挿入配列は、独自のアップタグおよびダウンタグバーコードとカスタム R スクリプトを介してナノポアとイルミナのデータセットを組み合わせることで、スクリーニングサンプル (ホスト、レジストーム、抗生物質) と関連付けられました。メタゲノムコンティグ内の ARG を同定するために、2 つの並行アプローチが使用されました: (1) prodigal 61 によるオープンリーディングフレーム (ORF) 予測、続いて CARD35 および ResFinder36 データベースに対する BLASTP 検索によるアノテーション。e 値 < でのカバレッジ >50 bp １０−５および（２）ＢＬＡＳＴＸ検索は、同じパラメータを使用するが、フレームシフト配列エラーによる切り捨てられたＯＲＦのリスクを低減するためにＯＲＦ予測を行わない。データセットから忠実度の低いシーケンスデータを除去するために、ナノポアデータセット内の 10 未満のコンセンサス挿入配列と Illumina アップタグおよびダウンタグバーコードデータセット内の 9 リード未満によってサポートされるメタゲノム DNA フラグメントをフィルターで除外しました。

メタゲノム DNA 断片に複数の予測 ARG が含まれている場合、選択実験で使用したもの以外の抗生物質クラス (CARD および ResFinder 参照データベースに基づく) に作用することが知られている ARG はフィルターで除外されました。少なくとも 95% の同一性と DNA 配列レベルの範囲を有する ARG 配列は、ARG クラスターに折りたたまれました 37。各クラスターは、Card35 および ResFinder36 データベース内の既知の ARG に最も近いヒットによって表されました (補足表 6)。構築された DNA コンティグ配列の起源となったドナー生物は、NCBI 参照原核生物データベース (RefProk、2021 年 3 月 21 日にダウンロード) に対するクエリとして DNA コンティグを使用し、しきい値 e 値 10-10 でヌクレオチド配列類似性検索によって同定されました。分類階層 (界、門、綱、目、科、属、種) は、R (v0.8.0) の Taxonomizr パッケージを使用して取得されました。

モバイル遺伝子カタログ (つまり、細菌種間で最近転送された DNA 配列のデータベース 40) を作成するために、以前と同様に、統合微生物ゲノムおよびマイクロバイオームデータベースから多様なヒト関連細菌種の 1,377 ゲノム 40 と、グラム細菌の 1,417 ゲノムをダウンロードしました。 NCBI RefSeq データベースからの陰性 ESKAPE 病原体 (補足表 8)。 NCBI blastn 2.10.1+62 を使用して、異なる種に属するゲノム間で共有されるヌクレオチド配列を検索しました。 NCBI blastn 2.10.1+ blast の結果をフィルタリングするためのパラメータは次のとおりです。同一性の最小パーセンテージは 99%。最小整列長さ、500。最大アライメント長、20,000。 blast ヒットは、配列同一性閾値 99% で cd-hit-est 4.8.163,64 によってクラスター化されました。私たちは、放蕩 v2.6.361 で爆発ヒットの ORF を予測し、500 nt より長いものだけを保持しました。次に、モバイル遺伝子カタログを生成するために、ダイヤモンド v2.0.4.14265 を使用して、統合された CARD 3.1.035 および ResFinder (d48a0fe)36 データベースと比較しました。最後に、PLSDB データベース (v2020-11-19) から 27,939 個の完全なプラスミド配列をダウンロードすることにより、天然のプラスミド配列が同定されました41。次に、単離された 114 個の ARG クラスターの代表的な配列が、モバイル遺伝子カタログと天然プラスミド配列の両方で BLASTN 検索され、同一性とカバレッジ閾値は 90% でした。可動性遺伝子カタログおよび/または天然プラスミド配列に存在する ARG は可動性であるとみなされました。

統計分析は R (v4.1.1) を使用して実行されました。パラメトリック 2 サンプル t 検定を使用して、サンプルのグループの平均間の差異を評価しました。フィッシャーの直接確率検定を使用して、2 つの変数間の有意な関連性を決定しました。シャノンアルファ多様性インデックスは、R66 の vegan パッケージ (v2.5 ～ 7) を使用してライブラリ内の DNA コンティグの多様性を特徴付けるために使用されました。データ分布は正常であると想定されていましたが、これは正式にテストされていませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究のためのイルミナのリードおよびナノポアコンティグは、EMBL-EBI のヨーロッパヌクレオチドアーカイブ (ENA) にアクセッション番号 PRJEB54063 (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB54063) で寄託されています。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

分析の再現に必要なスクリプトおよびその他のファイルは、https://github.com/stitam/Apjok-et-al-DEEPMINE-NatMicrobiol で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

土壌サンプルの収集とNBAの承認について、微生物学部のD. Verma氏とインドのラクナウにあるアンベードカル大学のB. Bhimrao氏に感謝します。この研究は、国立バイオテクノロジー研究所助成金 NKFIH-871-3/2020 および 2022-2.1.1-NL-2022-00008 (BK および CP) によって支援されました。欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラム（助成契約第2号に基づく） 739593 (BP および BK); 欧州研究評議会 H2020-ERC-2014-CoG 648364-Resistance Evolution (CP) および H2020-ERC-2019-PoC 862077–Aware (CP)。国立研究開発イノベーション局助成金 FK-135245 (BK) および FK-124254 (OM)。「最前線」プログラム KKP 129814 および 126506 (BP および CP) に基づく国家研究開発イノベーション局およびイノベーション技術省。国立健康安全研究所 RRF-2.3.1-21-2022-00006 (BP)、GINOP-2.3.2–15–2016–00014 (EVOMER、CP および BP)、GINOP-2.3.2–15–2016– 00020 (MolMedEx TUMORDNS、CP)、GINOP-2.3.2-15-2016-00035 (NZ); ハンガリー科学アカデミーのヤノシュ・ボリャイ研究フェローシップ (BO/352/20 (BK)、BO/00303/19/8 (OM))。人間的能力省の新しい国家優秀プログラム (UNKP-20-5-SZTE-654 および UNKP-21-5-SZTE-579、BK)。国家研究開発イノベーション基金 (ÚNKP-20-3 -SZTE-452、ジョージア州) の資金提供によるイノベーション技術省の新しいナショナルエクセレンスプログラム。国家研究開発イノベーション基金（KDP-17-4/PALY-2021、C992025、MS）の資金提供によるイノベーション技術省の協力博士課程プログラムの博士課程学生奨学金プログラム。 RH、BG、PU、および AG は、GINOP-2.3.4-15-2020-00010、GINOP-2.3.1-20-2020-00001、BECOMING-2019–1-HU01-KA203–061251、欧州連合の Horizon によってサポートされていました。マリー・スクウォドフスカとキュリーの助成契約第2号に基づく2020年度研究革新プログラム 754432 およびポーランド科学高等教育省、2018 年から 2023 年の科学のための財源から。この研究作業は、ハンガリー文化イノベーション省 (DK) の後援のもと、国立生物医学財団の国立科学アカデミー教育プログラムの支援を受けて実施されました。

プラモド・K・ジャンギル

現在の住所: オックスフォード大学動物学部、オックスフォード、英国

Gábor Apjok、Mónika Számel、Chryso Christodoulou などの著者も同様に貢献しました。

合成およびシステム生物学ユニット、生化学研究所、生物学研究センター、バイオテクノロジー国立研究所、エトヴェシュロラン研究ネットワーク (ELKH)、セゲド、ハンガリー

ガボル・アピョク、モニカ・ザメル、クリソ・クリストドゥロウ、ヴィクトリア・セレギ、バリント・マルク・ヴァサーヘリ、タマス・スターリング、バリント・エシェニ、トビアシュ・サリ、ファニ・ヴィドヴィクス、エリカ・ナグランド、ドリーナ・コヴァチ、ペトラ・シリ、イルディコ・イロナ・ラントス、オルソリヤ・メヒ、プラモドK. ジャンギル、ガボールドラスコヴィッツ、アコス・ニエルゲス、ゲルゲリー・フェケテ、バラズ・パップ、パル・チャバ、バリント・キンツェス

セゲド大学生物学博士課程（ハンガリー、セゲド）

ガボール・アピョク、モニカ・ザメル、タマス・スターリング、トビアシュ・サリ、プラモド・K・ジャンギル

HCEMM-BRC トランスレーショナル微生物学研究グループ、セゲド、ハンガリー

ヴィクトリア・セレギ & バリント・キンツェス

生化学研究所、生物学研究センター、国立健康安全研究所、エトヴェシュロラン研究ネットワーク (ELKH)、セゲド、ハンガリー

タマス・スターリング & バラーズ・パップ

セゲド大学、ハンガリー、セゲド、学際的医科学博士課程

ペトラ・シリ

ハンガリー、ペーチ大学、センタゴタイ研究センター、ゲノミクスおよびバイオインフォマティクス中核施設、バイオインフォマティクス研究グループ

ロベルト・ヘルツェグ、ベンス・ガリク、ペテル・ウルバン、アッティラ・ギネセイ

ビアウィストク医科大学、臨床分子生物学部、ビアウィストク、ポーランド

ベンス・ガリク & アッティラ・ギエネセイ

セゲド大学、科学情報学部、生化学および分子生物学科、セゲド、ハンガリー

ラスロー・ボダイ & バリント・キンツェス

セゲド大学科学情報学部遺伝学科（ハンガリー、セゲド）

ノラ・ツィンデリ

獣医診断総局、国家フードチェーン安全局、ブダペスト、ハンガリー

デネス・ベラ

テルアビブ大学サックラー医学部臨床微生物学および免疫学教室、テルアビブ、イスラエル

イド・ヨセフ & ウディ・キムロン

HCEMM-BRC 代謝システム生物学研究所、セゲド、ハンガリー

バラーズ・パップ

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GA と BK がこのプロジェクトを発案しました。 MS、GA、CC、BMV、T.Sári、EN、PKJ、AN、CP、BK が実験とデータ分析を計画しました。 MS、GA、VS、DK、IIL、FV、BE、T.Sári、PS、EN、OM、GD、BD が実験を実施しました。 LB、NZ はイルミナシーケンスを実行し、RH、BG、PU、AG はナノポアシーケンスを実行しました。 MS、GA、CC、BMV、T.Stirling、GF、RH、BP、CP、BK は実験データを分析し、バイオインフォマティクス分析を実施しました。 BK、CP、CC、MS、GA は、すべての著者からの寄稿を受けて原稿を執筆しました。

Pál Csaba または Bálint Kintses への通信。

GA、MS、T.Sári、OM、UQ、BK は、DEEPMINE (欧州特許庁) に提出された特許出願の発明者です。 Biological Research Center Szeged は DIVERGE に関する有効な特許を保有しており (PCT/EP2017/082574、US 10,669,537 B2、欧州特許 No. 3526327)、BK と CP が発明者です。 UQ は、Trobix Innovation Ltd の最高技術責任者であり、拡張された宿主範囲を有するバクテリオファージ変異体を生成する方法に関する係属中の特許出願の発明者です (PCT/IL2017/050734)。他のすべての著者には競合する利益はありません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Trevor Charles、Kevin Forsberg、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、エレクトロポレーション効率と形質導入効率の比較。この図は、3 つの病原性宿主種すべてにおいて、宿主に送達されるプラスミドの最大数が、エレクトロポレーションよりも形質導入の方が少なくとも 2 桁多いことを示しています (中心バーとエラーバーは平均誤差と標準誤差を表します (n= 3 つの生物学的に独立した実験) ）。データは補足表 2.b で入手可能です。b、形質導入細胞からの PCR 増幅メタゲノムインサート。形質導入およびエレクトロポレーションの後、メタゲノム DNA 断片の両側でプラスミド特異的プライマーを使用してメタゲノム DNA 断片を PCR 増幅し、続いてキャピラリーシークエンシングによって配列決定しました。この実験では、モノクローナル細胞 (単一の PCR 産物と DNA 配列) を、2 つ以上のプラスミドによって共形質導入された細胞 (ゲル上の二重バンドおよびキャピラリー配列内の混合シグナル) から区別します。各ホストとライブラリーのペアの場合に PCR を繰り返しましたが、同様の結果が得られました。 c. 形質導入バクテリオファージ粒子の生成中、ファージの大部分は複製を維持し、ファージ生成に使用された細菌細胞を殺します。したがって、ファージ濃度が増加すると、形質導入効率は予想されるほど増加せず、低下します。この図は、異なる希釈率での、Shigella Sonnei HNCMB 25021 上の T7 ファージテール (黒線) を保持する T7 形質導入ファージ粒子の形質導入効率を示しています (方法を参照)。赤い破線は、複製ファージの検出可能な殺傷効果がなくても、形質導入効率の予想される増加を示しています。データは補足表 2 で入手可能です。

ソースデータ

a, 変異型 T7 gp17 HRDR は通常、特定の変異の組み合わせを持ち、その 28% は以前に適応変異として記載されています。 50 個の配列決定された T7 ファージテール HRDR で突然変異が発生するケースの数を表すヒートマップ。 (Huss et al.28) による適応突然変異は赤い点で示されています。特定の適応変異の頻繁な組み合わせは、DIvERGE が宿主特異性を変える変異を高効率で発見できる可能性を示しています。データは補足表 4 で入手可能です。b、c、変異誘発ファージ尾部繊維遺伝子エシェリヒアファージ T7 gp17 およびサルモネラファージ ΦSG-JL2 gp17 全体で検出された変異の分布。予測される HRDR は、T3 バクテリオファージの場合 (Yehl et al.29) と同様に、色付けされた領域によって区別されます。 d、大腸菌K12 BW25113 ΔtrxAΔwaaR LPS欠損株を用いた野生型対応物と比較した、変異体T7（灰色）およびΦSG-JL2（黄色）ファージ尾部の形質導入効率。 Y 軸は、1 mL 中の形質導入された細胞の数を示します。中心バーとエラーバーは平均誤差と標準誤差を表します (n = 3 回の生物学的に独立した実験)。濃縮された変異体サルモネラファージ Vi06 gp43 は観察されなかったことに注意してください。これは、サルモネラファージ Vi06 尾部繊維が LPS 以外の細胞表面受容体に結合することを示しています。データは補足表 4 で入手可能です。

ソースデータ

a、T7 gp17WTによる形質導入ファージ粒子生成の概略図。プロセスの最初のステップでは、ゲノム内の遺伝子をコードする尾部繊維を欠いているが、野生型 T7 尾部繊維を表示している T7 バクテリオファージが、メタゲノムプラスミドとファージテールを発現するプラスミドを保持する大腸菌 BW25113 細胞に感染します。 Yosefらによると、感染により、メタゲノムプラスミド(形質導入ファージ粒子)またはファージゲノム(複製ファージ)のいずれかを保持するファージ粒子が生成される。ファージテールを発現するプラスミドによってコードされる（したがって、生成されたT7粒子上に表示される）ファージテールが大腸菌に効率的に感染できる場合、ファージ粒子を含むファージゲノムが新たな複製を開始できるため、プロセス中に連続的なファージの複製が蓄積します。サイクル。 b、gp17WT (青色) または gp17V544G (緑色) 尾部繊維を保有する T7 ファージ粒子によって、Shigella Sonnei HNCMB 25021 に送達されるメタゲノムプラスミドの数 (2 サンプルの片側 t 検定、P = 0.01944。中心と誤差)バーは平均値と標準誤差を表します、n = 3 の生物学的に独立した実験)。データは補足表5にあります。c、gp17WT（青色）またはgp17V544G（緑色）尾部繊維を有するT7形質導入ファージ粒子のプラーク形成によって測定された複製ファージ汚染（方法を参照）。プラークアッセイは、大腸菌 BW25113 とゾンネブドウ球菌 HNCMB 25021 の両方を用いて実施されました (2 サンプルの両側 t 検定、大腸菌とソンネイブドウ球菌をそれぞれ適用した場合、P = 0.000168 および P = 0.013476)。誤差バーは平均誤差と標準誤差を表します;n = 3 生物学的に独立した実験)。データは補足表5にあります。d、gp17WT（青色）またはgp17V544G（緑色）尾部繊維を有するT7ファージ粒子を形質導入したS.sonnei HNCMB 25021コロニー数によって測定された複製ファージ汚染。 T7 gp17V544G 形質導入粒子サンプル中の複製ファージの量が少ないことは、高濃度の形質導入粒子でもコロニー数が増加していることによって示されます。特に、補足図5cとは異なり、この実験では複製ファージ活性が形質導入粒子の最高濃度で検出されます。（n = 2の生物学的複製。中心とエラーバーは平均誤差と標準誤差を表します。）データは補足表5で入手可能です。e、大腸菌のgp17WT（青）またはgp17V544G（緑）尾繊維を有するT7ファージ粒子の形質導入効率BW25113 (2 サンプルの両側 t 検定、P = 0.00553、n = 3 つの生物学的に独立した実験。中心とエラーバーは平均と標準誤差を表す)。データは補足表 5 にあります。f、T7 gp17V544G を使用した想定される形質導入ファージ粒子生成スキームの概略図。大腸菌 BW25113 の形質導入効率の低下により、最初の感染サイクル後の複製ファージの再生が無効になります。最初の感染サイクルは T7 gp17WT によって実行されることに注意してください。要するに、変異体ファージ尾部による大腸菌の非効率的な感染により、複製ファージの量が減少することになる。

ソースデータ

a、機能的なメタゲノムプラスミドライブラリーの送達は、T7 gp17V544G バクテリオファージ粒子による Shigella Sonnei HNCMB 25021 への送達と、エレクトロポレーションによる大腸菌 BW25113 への送達と同じくらい効率的です (P = 0.19769、2 サンプルの片側 t 検定、n = 3 の生物学的に独立した実験。中央とエラーバーは平均誤差と標準誤差を表します。）補足表2で利用可能なデータ。b、c、エレクトロポレーションと形質導入の直後にロングリードディープシーケンシングを使用して決定された、それぞれ送達されたメタゲノムDNA断片の長さと多様性（方法）。破線は DNA 断片の平均サイズを表します。シャノンアルファ多様性指数 (H) は、ライブラリー内の同一配列を持つフラグメントの頻度に基づいて計算されました (大腸菌とソンネイの場合、それぞれ n = 276899、n = 162107)。データは補足表 3 で入手可能です。

ソースデータ

このパイプラインは、以前に公開されたワークフロー (Dual Barcoded Shotgun Expression Library Sequencing Pipeline (Mutalik et al.34)) に似ていますが、耐性を付与するメタゲノム DNA 断片の PCR 増幅を回避する変更が加えられているため、サンプルの元の組成が保存されます (方法) ）。ワークフローは次の手順で構成されます。まず、スクリーニングから得られた機能的なメタゲノムプラスミドをすべてプールし、SrfI 制限エンドヌクレアーゼを使用して線状化しました。 SrfI には、メタゲノムインサートの消化を最小限に抑えるための 8 塩基対の長さの認識配列があります。次に、線状化されたプラスミドを Nanopore ロングリードシークエンシングに供します (メソッド)。ロングリードシーケンシングにより、メタゲノム DNA フラグメント (挿入) と、各メタゲノム DNA フラグメントの上流および下流 (それぞれ Uptag および Downtag) にプレクローン化された 2 つの 10 ヌクレオチド長のランダムバーコードが特定されます (方法)。並行して、各スクリーンからのメタゲノムプラスミドをプールする前に、多重化ショートリードディープシークエンシングを適用して、各機能的メタゲノムスクリーンのメタゲノム断片の両側にあるプラスミドにコードされた固有のバーコードを読み出しました。具体的には、Uptag および Downtag 配列を、バーコード化された Illumina シーケンシング互換プライマー (BC) を使用して PCR 増幅しました。 BC バーコードを使用したイルミナのシーケンシングとサンプルの逆多重化に続いて、Nanopore とイルミナのデータセットを組み合わせて、各プラスミド (アップタグとダウンタグで識別) を、固有の宿主、抗生物質、およびライブラリーの組み合わせであるスクリーニングバッチに割り当てます。

a. 4 つのホストのそれぞれで一意に同定された ARG のパーセンテージ (青)、および少なくとも 1 つ以上のホストと重複して同定された ARG (赤)。大腸菌は 114 個の ARG のうち 57% のみを識別しました。 b. 平均して、反復スクリーニングの変動性 (83%) を考慮すると、検出された ARG のわずか 44% (水平破線でラベル付け) が種のペア間で重複します。これは、種のペア間の重複のパーセンテージをで割ったものです。複製画面間のオーバーラップの割合 (0.365/0.83)。データはソースデータファイル 6 で利用できます。箱ひげ図は中央値 (中央の水平線)、第 1 四分位数と第 3 四分位数 (それぞれボックスの下端と上端) を示し、ひげは最大 (最小) 値または四分位間範囲の 1.5 倍を示します。データ; 大腸菌の場合は n = 80、肺炎桿菌の場合は n = 101、S. enterica の場合は n = 56、S. Sonnei の場合は n = 37、「n」は特定の宿主内で特定された ARG の数です）。データは補足表 6 にあります。

a, 図は、異なる系統グループに由来する ARG の数と、宿主およびレジストームにわたる各グループの分布を示しています (n = 114)。 ARG の大部分はプロテオバクテリアに由来します。ソースデータファイル 7 で利用可能なデータ。b、図は、さまざまなメカニズムカテゴリで特定された ARG の数と、複数のホストとの各カテゴリの機能互換性を示しています (n = 114)。最も頻繁に使用されたカテゴリーは、抗生物質の不活化、抗生物質の流出、および抗生物質の流出の調節物質でした。データは補足表 7 で入手可能です。

a、少なくとも 1 つの種で耐性表現型を提供するために検出された ARG と比較して、いずれの種でも耐性表現型を提供するために検出されなかった ARG の有意に高い部分が、単一の耐性を付与する DNA 断片上に存在していました (Two-tailed Fisher's正確検定、P = 0.032、n = 80、補足表 10)。 b. ゴールドスタンダードデータセットとしての MIC 測定値の取得に基づくスクリーニングの推定精度。 4 つの宿主細菌種のそれぞれへのこの ARG の再導入は、プラスミドライブラリーの配列決定によって確認されなかったため、MIC 測定から 1 つの ARG (QnrB73) を除外したことに注意してください (ソースデータファイル 9)。 MIC データセットにおける耐性の存在は、相対 MIC 値の 2 倍を超える変化として定義されました。偽陰性ヒットとは、スクリーニングでは検出されなかったが、MIC 測定では耐性表現型を示した ARG です。偽陽性ヒットとは、MIC 測定では耐性を示さなかったが、スクリーニングでは耐性表現型を示すことが検出されたものです。私たちは、プラスミドのヒッチハイクが偽陽性の主な原因であると想定しました。データは補足表 9c、確率的アプローチ (方法) を使用して測定精度を制御した後の宿主種のペア間の機能的 ARG セットの重複を表す、調整された Jaccard 類似性係数の分布で入手できます。破線、青線、赤線はそれぞれ宿主種ペアの測定された Jaccard 類似性係数、調整された Jaccard 類似性係数の中央値、95% 信頼区間の下限と上限を表します。 d. 合計すると、ARG の約 46% (63 個中約 29 個) のみが、4 つの細菌宿主種すべてに耐性をもたらすと推定されています。ヒストグラムは、確率的アプローチを使用してスクリーニングの偽陽性および偽陰性率を考慮した場合に、4 つの宿主種すべてに耐性を与えると推定される ARG の数を示します (「方法」を参照)。破線、青線、赤線はそれぞれ宿主種ペアの測定された Jaccard 類似性係数、調整された Jaccard 類似性係数の中央値、95% 信頼区間の下限と上限を表します。 (「メソッド」を参照)。

a、ARG の総数は、どのマイクロバイオームが考慮されたかに関係なく、古い抗生物質グループと新しい抗生物質グループで統計的に同じです。 (人為的土壌: P = 0.4377、人間関連 (腸/臨床): P = 0.601、ウェルチ 2 サンプルの両側 t 検定、新旧の n = 5 および n = 5、ここで「n」はそれぞれ抗生物質の数。箱ひげ図は中央値 (中央の水平線)、第 1 四分位数と第 3 四分位数 (それぞれ箱の下端と上端) を示し、ひげはデータの最大 (最小) 値または四分位間範囲の 1.5 倍を示します。）。 b、上記の結果は、分析が確立された水平遺伝子伝達事象を伴うARGに限定された場合にも残りました（人為起源の土壌：P = 0.1994、ウェルチ二標本の両側t検定、新旧についてn = 3およびn = 2、ここで、「n」はそれぞれ抗生物質の数を表します;ヒト関連 (腸/臨床): P = 0.6426、ウェルチ 2 サンプル t 検定、新旧それぞれ n = 4 および n = 5)。データは補足表 7 にあります。

補足方法、拡張データ表 1 の説明、補足表 1 ～ 11、およびソースデータ拡張データ図。 1～4。

補足表 1 ～ 11。

拡張データ図 1 のゲル写真のトリミングされていないスキャン（肺炎桿菌 NCTC 9131 + K11 ファージによる土壌ライブラリー）。

拡張データ図 2 のゲル写真のトリミングされていないスキャン (Salmonella enterica subsp. enterica 血清型 Typhimurium str. LT2 + ΦSG-JL2 ファージによる腸ライブラリー)。

拡張データ図 3 のゲル写真のトリミングされていないスキャン (Salmonella enterica subsp. enterica 血清型 Typhimurium str. LT2 + ΦSG-JL2 ファージによる臨床ライブラリ)。

拡張データ図 4 のゲル写真のトリミングされていないスキャン (大腸菌 K12 BW25113 へのエレクトロポレーション)。

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転載と許可

Apjok, G.、Számel, M.、Christodoulou, C. 他臨床株における再プログラムされたバクテリオファージによる機能的メタゲノミクスによる抗生物質レジストームの特性評価。 Nat Microbiol 8、410–423 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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受信日: 2021 年 11 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 4 日

公開日: 2023 年 2 月 9 日

発行日：2023年3月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01320-2

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再プログラムされたバクテリオファージによる抗生物質レジストームの特性評価