デュアル幹細胞アプローチによる心筋梗塞後の効果的な血管再生の強化戦略

Experimental & Molecular Medicine volume 54、pages 1165–1178 (2022)この記事を引用

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心筋梗塞（MI）後の冠状血液供給障害は心機能に悪影響を与えるため、血管新生治療は細胞ベースの心臓修復の主要な治療戦略の1つと考えられています。 ここでは、虚血性心臓における血管新生の治療をより効果的に達成するために、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC-EC）由来のCD31+内皮細胞と遺伝子操作された2つの異なるタイプの幹細胞を利用することにより、効果的な血管再生のためのデュアル幹細胞アプローチを開発しました。間質由来因子-1α (SDF-eMSC) を継続的に分泌し、血管新生の 2 つの中心的な機構である出生時の血管形成と血管新生を同時に促進するヒト間葉系幹細胞。 より包括的な血管再生を誘導するために、我々は心筋内にhiPSC-ECを注入して、おそらく血管新生を介して新たな血管を生成し、SDF-eMSCをカプセル化した3D心臓パッチ（SDF-eMSC-PA）を使用して、次のようなパラクリン因子の持続的な分泌を通じて血管新生を促進しました。 SDF-1αは、虚血心臓の心外膜に移植されました。 我々は、hiPSC-ECが虚血心臓における新規血管形成に直接寄与し、その結果心機能が強化されることを検証した。 さらに、SDF1α-eMSC-PA の同時移植により、hiPSC-EC の生存、保持、血管新生の可能性が大幅に改善され、最終的には MI 心臓におけるより包括的な血管新生が達成されました。 注目すべきことに、二重幹細胞アプローチによって新たに形成された血管は、hiPSC-EC 単独によって形成された血管よりも大幅に大きく、より機能的でした。 結論として、これらの結果は、効果的な血管再生のための我々の戦略が虚血性心疾患を治療する効果的な手段となり得るという説得力のある証拠を提供するものである。

虚血性心疾患（IHD）は、世界中で罹患率と運動性の主な原因の 1 つです1。 特に、IHD の代表的な形態である心筋梗塞（MI）は、心筋と血管の両方に過度の損傷を与えます2。 冠状血管への損傷はMIにおける最も重大な病態生理学的病因の1つであるため、これまでのアプローチは治療的な血管新生を通じて虚血心臓の機能的に灌流可能な血管系を再構成することに焦点を当ててきた3。 前臨床研究からの有望な結果にもかかわらず、その後の臨床試験から得られた結果は一貫した決定的な結果を生み出すことができませんでした。 前臨床結果と臨床結果との間のこの不一致について考えられる説明の 1 つは、長期の血管新生刺激のために標的領域内のターゲティング血管新生因子の最適レベルを一定期間維持できないことです。これは技術的に困難であり、法外に高価であると考えられています 4。

虚血心臓では血管新生治療によって灌流可能な血管構造を再構築できることが、より広く受け入れられるようになってきています5。 以前のいくつかの研究では、治療的な血管新生は一般に、血管新生と血管新生という 2 つの異なるプロセスから構成されることが説明されています。 血管新生は既存の血管の成長として定義され、血管新生は内皮細胞 (EC)、内皮前駆細胞 (EPC)、または他の種類の幹細胞からの血管の新規生成を指します6。 これまでのいくつかの研究で、血管新生の誘導が血管再生に効果的であることが広く報告されているため、虚血性心疾患を治療するために心筋血管新生を促進する効率的な戦略を開発するために多大な努力が費やされてきた。 例えば、多くの前臨床設定では、血管内皮増殖因子 (VEGF)、線維芽細胞増殖因子 (FGF)、肝細胞増殖因子 (HGF) などの血管新生促進因子を、組換えタンパク質、裸の DNA プラスミド、または修飾されたVEGF RNAは、血管形成、心筋機能、および長期生存率を大幅に改善することが示されており、血管新生の促進が不全心臓の治療に効果的な治療戦略であることを示しています。

血管新生は胎児期と成人期の両方で起こることが知られていますが、血管新生は胎児の発育中にのみ起こると考えられています7。 しかし、最近の証拠は、血管形成が初期胚形成に限定されず、出生後の血管疾患の病態生理学にも寄与している可能性があることを示唆しています8。 この概念は、EC と EPC の両方が循環中に共存し、腫瘍の成長中に新しい血管が発達するという観察から生まれました。 成体脊椎動物における循環 EPC のこの同定は、出生後の血管形成における骨髄由来のいくつかの種類の細胞の機能的役割を新たに示唆しました 9。 その後、いくつかの研究で、EPC、単核細胞 (MNC)、および間葉系幹細胞 (MSC) の移植が成人虚血組織における治療的血管新生を誘導したことが報告されました 10、11、12。 しかし、それらの主な機構が新たな血管形成ではなくパラクリン効果を伴うため、EC に分化して連続的な血管形成を受ける可能性は最適とは言えません。 より最近では、ヒト胚性幹細胞 (hESC) およびヒト人工多能性幹細胞 (hiPSC) を含むヒト多能性幹細胞 (hPSC-EC) に由来する EC が、血管形成のための新しい細胞源として示唆されています。 hPSC-EC は他の細胞に比べて比較的高い血管形成能を示しましたが、血管形成を誘導する能力は依然として不十分で非効率的です 13、14、15。 例えば、後肢虚血モデルに hPSC-EC を適用した最近の研究では、虚血組織に機能的な血管が形成されるまでに数か月かかることが実証され、血管形成における hPSC-EC の可能性が限られていることを示唆しています。 したがって、虚血組織における血管新生の治療に hPSC-EC をより効果的に使用するには、血管新生の可能性を促進する革新的な方法を開発する必要があります。

したがって、現在の研究では、間質由来因子-1αを継続的に分泌するCD31+ hiPSC-ECとヒト骨髄由来の遺伝子操作されたMSCという2つの異なるタイプの細胞ソースを利用することにより、虚血心臓の血管系を効果的に再構築する戦略を開発しました。 ＭＩ誘発心臓の心外膜に移植された三次元（３Ｄ）心臓パッチ内の（ＳＤＦ−ｅＭＳＣ）。 我々は、心筋内に注入されたhiPSC-ECは血管新生を介して新たな血管を生成するのに対し、心外膜に移植されたSDF-eMSCパッチ（SDF-eMSC-PA）は、血管新生パラクリン因子、特にSDFの分泌と一致して宿主血管の血管新生を同時に促進すると仮説を立てています。 MI 誘発心臓の場合。 天然血管新生の基礎は血管新生に限定されず、出生後の血管新生も含まれるため、虚血心臓における真の血管再生を達成するために、治療的血管新生を標的とする戦略はこれらすべてのプロセスを包括的に誘導することに焦点を当てるべきであると我々は推論した。 SDF-1αを含むいくつかの有益なサイトカインを分泌するための細胞リザーバーとしてSDF-eMSC-PAを使用するために、心臓由来細胞外マトリックス（hdECM）ヒドロゲルを使用して、心臓組織特有の微小環境を可能な限り忠実に再現しました。 その後、我々は、hiPSC-EC と SDF-eMSC-PA を用いた二重細胞アプローチが血管形成の大幅な改善と心機能の強化につながることを実証しました。 これらの結果は、虚血心臓における血管再生に対する重要な治療的意義を示唆している。

hdECM は前述のように調製されました 16、17。 簡単に説明すると、生後 6 か月の韓国産豚の心臓組織を、供給者の承認を得て畜産物市場から購入しました。 我々は、完全なブタの心臓から左心室を解剖し、それを小片に切断した。 心臓組織の小片を 1% ドデシル硫酸ナトリウム (Affymetrix、CA) 溶液に 48 時間浸漬し、続いて 1% Triton X-100 の PBS 溶液 (Biosesang、韓国) で 1 時間処理しました。 次に、脱細胞化組織を PBS に 3 日間浸漬して、残留界面活性剤を除去しました。 続いて、脱細胞化心臓組織を凍結乾燥し、液体窒素中で粉砕し、10 mL の 0.5 M 酢酸溶液 (Merck Millipore、マサチューセッツ州ビレリカ) で最終濃度 3.3 w/v% (hdECM 粉末 330 mg) で消化しました。ペプシンパウダー33mg。 消化された hdECM 溶液を 40 μm 孔メッシュで濾過し、1 mL に等分し、さらなる実験のために -20 °C で保存しました。 心臓パッチを製造する前に、hdECM のゲル化を避けるためにコニカルチューブをアイスバケット内に保ちながら、10 N NaOH 溶液を加えることにより、hdECM 溶液を中性 pH 7.4 に調整しました。

すべての動物研究は、韓国カトリック大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました (承認番号: CUMC-2020-0051-01)。 IACUC と韓国カトリック大学ソンイキャンパスの実験動物学部 (DOLA) は、2017 年に韓国食品医薬品局からコリアエクセレンス動物実験施設を認定され、2018 年に AAALAC 国際完全認定を取得しました。すべての動物処置は、米国のガイドラインに準拠していました。科学目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令 2010/63/EU、または NIH ガイドライン。 Fischer 344 ラット (160 ～ 180 g、雄、Koatec、韓国) を 2% 吸入イソフルランで麻酔し、18 ゲージの静脈内カテーテルを気管から挿管しました。 次いで、ラットに齧歯類用人工呼吸器（５５－７０５８、ハーバード装置、カナダ）を用いて機械的に換気した。 処置中の冷却を防ぐために、動物を 37 °C の加熱パッドの上に置きました。 胸部を剃り、70％アルコールで消毒した後、左開胸術を行いました。 左前下行枝（LAD）に配置した滅菌ポリエチレングリコールチューブ（22G）で縫合糸を1分間結ぶことによってMIを誘発し、7-0プロレン縫合糸を使用して結び目を永久的に結紮した。 ベースラインの左心室機能を確立するために、手術日 (POD) 7 後の駆出率 (EF) を検査しました (包含基準: 心エコー評価に基づく EF < 45%)。 翌日、イソフルラン吸入を使用してラットを再び麻酔し、挿管し、機械換気した。 動物の胸部を再び開き、梗塞した心臓から心膜を部分的に除去した。 以下の 5 つの実験グループ：（1）偽コントロール、（2）MI コントロール、（3）SDF-eMSC-PA 移植された MI 心臓の心外膜（PA のみ、1 × 106）、（4）hiPSC-EC、心筋内注射（ EC のみ、1 × 106）、および（5）hiPSC-EC と SDF-eMSC-PA の組み合わせプラットフォーム（EC + PA、それぞれ 1 × 106）。 hiPSC-EC を梗塞した心臓の境界領域の 2 つの異なる部位に注射し、3D 心臓パッチ (直径: 1 cm) を 3 本の縫合糸を使用して心外膜に直接移植しました。 胸を無菌的に閉じ、抗生物質と 0.9% 生理食塩水を投与しました。 全てのラットには、前述のように以下の免疫抑制剤を投与した：18,19 アザチオプリン、2 mg/kg。 シクロスポリン A、5 mg/kg。 メチルプレドニゾロン、毎日 5 mg/kg。

動物をイソフルランで軽く麻酔し、加熱パッドを使用して 37 °C に維持しました。 損傷した心臓組織の機能改善の評価は、以前に説明したように心エコー検査で実施されました20,21。 ラットを吸入イソフルランで軽く麻酔し、15 MHz L15-7io リニアトランスデューサ（Affniti 50 G、Philips）を備えた経胸腔心エコー検査システムを使用して生理学的データを記録した。 細胞治療前、2、4、および8週間後に連続心エコー図を実施しました。 心エコー検査のオペレーターは、実験中、グループの割り当てについて知らされていませんでした。

血行力学的測定は、安楽死の 8 週間前に実施されました。 出血を伴わずに開胸した後、心室の心尖部を２６ゲージの針で穿刺し、２Ｆコンダクタンスカテーテル（ＳＰＲ－８３８、Ｍｉｌｌａｒ）をＬＶに挿入した。 左室圧容積（PV）パラメータは、デジタルコンバータ（PowerLab 16/35、ADIstruments、コロラドスプリングス、コロラド州）に接続されたPVコンダクタンスシステム（MPVS Ultra、EMKA Technologies、パリ、フランス）を使用して継続的に記録されました。 収縮終期圧容積関係 (ESPVR) および拡張終期圧容積関係 (EDPVR) の傾きを含む、負荷に依存しない心機能の測定値は、一過性下大静脈 (IVC) を介して誘発されたさまざまな前負荷で取得されました。持針器による閉塞。 高張食塩水 (20% NaCl) のアリコート 50 μl を左頸静脈に注射し、血行動態測定後の平行コンダクタンスを計算しました。 血液を左心室からヘパリン添加シリンジに採取し、キュベットに入れて、カテーテルを使用してコンダクタンス信号を体積に変換しました。 ラットの絶対体積は、平行コンダクタンスとキュベットコンダクタンスを校正することによって定義されました。

周囲の線維症および生存可能な心筋を決定するために、マッソントリクローム染色（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）を以下のように実施した。 簡単に説明すると、3 枚のパラフィン スライドを 37 °C の乾燥オーブンでプレインキュベートした後、脱パラフィンと再水和を行いました。 次に、パラフィン切片を 56 °C のブアン溶液中で 1 時間再固定しました。 これらの切片を、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン溶液を用いて室温で１５分間染色し、さらにビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液を用いて室温で２０分間染色した。 最後に、切片をアニリンブルーで 15 分間対比染色し、続いて 1% 酢酸で室温で 1 分間インキュベートしました。 各ステップの間に大規模な洗浄を実行しました。 続いて、スライドスキャナー（Pannoramic MIDI）を用いて心臓切片の撮像を行った。 線維症の比率は、LV周囲の面積に対する線維症の面積[(梗塞面積/LV壁面積) * 100]として計算した。 さらに、生存心筋の比率は、LV壁が拡張し、線維化領域が示される梗塞領域内の生存心筋の面積として定量化された。 [(生存心筋面積/梗塞面積) * 100]。 どちらの測定も、ImageJ ソフトウェアを使用して実行されました。

すべての定量的データは、特に指定のない限り、平均値 ± SD として表示されます。 2 つのグループ間の有意差は、両側スチューデント t 検定によって分析されました。 4 つのグループ間の有意差は、Bonferroni の事後分析を使用した ANOVA によっても分析されました。 p 値が 0.05 未満の場合、結果は統計的に有意であると見なされます。

以前のいくつかの研究では、GSK3 阻害剤を含む小分子の組み合わせを使用して、hiPSC から EC (hiPSC-EC) を生成することに成功したことが報告されています 22。 以前のレポートに基づいて、GSK3阻害剤CHIR99021を使用してhiPSCからhiPSC-ECを生成しました（補足材料と方法、補足図1a）。 さらなる実験で心臓組織内の細胞追跡を容易にするために緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するhiPSC-ECを作製するために、GFPレンチウイルス粒子をトランスフェクトすることによってGFPシグナルを発現するhiPSCを作製し、GFP発現に基づくFACSによってそれらを濃縮し、それらを区別するために使用した。 ECに変換します（補足図1b）。 qRT-PCRの結果、EC系統に分化しているhiPSCでは、多能性マーカーであるOCT4の発現レベルが大幅に低下し、ECの特異的マーカーであるCD31の発現レベルが大幅に増加していることが確認されました（補足図1c、補足表 1)。 分化 7 日目に、分化中の hiPSC-EC の約 25.08% がヒト CD31 抗体陽性であることを観察し、その後、FACS によってこれらの CD31+ 細胞を濃縮しました。 FACSの後、濃縮されたCD31 + hiPSC-ECは、EC系統細胞としての特性を維持するために、VEGFを含むサイトカインを含むヒト内皮無血清培地で維持されました（補足図1c）。 CD31+ hiPSC-EC は、典型的な石畳のような EC 形態を示し、分化クラスター 31 (CD31)、血管内皮カドヘリン (VE-Cadherin)、フォン ヴィレブランド因子 (vWF) などの EC 特異的マーカーの同様の mRNA レベルを発現しました。血管内皮増殖因子受容体 2 (VEGFR2) とヒト臍帯内皮細胞 (HUVEC) との比較 (補足図 1c、d)。 フローサイトメトリー分析の結果は、CD31 + hiPSC-ECがCD31およびCD144に対してそれぞれ97.19％および85.53％陽性であることをさらに実証しました（補足図1e）。 さらに、免疫蛍光の結果により、CD31+ hiPSC-EC が豊富なレベルの CD31 および vWF タンパク質を発現していることが確認されました（補足図 1f）。 機能レベルでは、CD31 + hiPSC-ECは、Ac-LDLの取り込み能力（補足図1g）およびマトリゲル上部の毛細管様ネットワークの形成（補足図1h）を示しました。

CD31+ hiPSC-EC（以降はhiPSC-EC）がMI誘発性心臓において血管形成依存性機構を介して新たに血管を形成できるかどうかを調べるために、我々はMI誘発性心臓の境界領域の2つの異なる部位にhiPSC-ECを心筋内注射した。ネズミの心臓。 MI は、心臓の左前下行枝 (LAD) 動脈の結紮によって発生しました。 緑色蛍光 (GFP) シグナルを継続的に発現する hiPSC-EC を追跡目的に使用しました。 MI 誘発心臓の機能血管を視覚化するために、hiPSC-EC 注射の 8 週間後に組織を採取する前に、赤色蛍光色素ローダミンと結合した isolection-B4 (IB4) を心臓に灌流染色しました。 蛍光画像分析により、hiPSC-ECを注入した心臓のIB4+毛細血管の数がMI対照心臓のIB4+毛細血管の数よりも有意に多いことが示されました（図1a）。

a 梗塞領域、境界領域、および遠隔領域、およびhiPSC-ECの注射後8週間におけるIB4-ローダミン（赤）で染色された血管の代表的な画像とその定量化の概要。 定量化のために、各心臓の 5 つのランダムに選択された領域 (mm2) 内の毛細血管の数がカウントされました。 n = 5。*p < 0.05。 スケールバー: 100 μm。 b iPSC-ECs-GFP (緑色)、IB4-ローダミン (赤色)、および DAPI (青色) によって新たに形成された血管の代表的な画像。 スケールバー: 20 μm。 c-j MIを受けているラットにhiPSC-ECまたは対照細胞を心筋内注射し、その後心エコー検査を行った。 c MIモデリングとiPSC-ECの移植から心機能の測定までの概略タイムライン。 d 左心室駆出率（EF）、（e）左心室短縮率（FS）、（f）左心室拡張期内寸法（LVIDd）、（g）左心室収縮期内寸法（LVIDs）、（h）中隔壁厚（ SWT）、（i）後壁厚さ（PWT）、および（j）相対壁厚さ（RWT）。 n = 6。 *p < 0.05。 k 細胞処理の8週間後に採取した心臓をマッソントリクロームで染色した後の心臓線維症を示す代表的な画像。 心臓線維症（l）と生存心筋（m）の定量結果。 n = 5。*p < 0.05。 スケールバー: 2000 μm。

次に、MI 心臓における血管形成に対する hiPSC-EC の寄与の可能性と大きさを評価するために、心臓組織内の hiPSC-EC からの GFP および RFP シグナルを追跡しました。 共焦点顕微鏡画像は、注射後 8 週間で hiPSC-EC を投与された心臓組織の梗塞領域に、hiPSC-EC からの IB4 および GFP シグナルの両方に対して二重陽性であるかなりの数の血管を示しました。 興味深いことに、かなりの数のhiPSC-ECが宿主の毛細血管ネットワークに組み込まれており、それらの多くは血管周囲領域に位置していました（図1b）。 この結果は、hiPSC-EC が虚血心臓で新たに血管を再構築できることを明らかに示唆しています。

血管形成を通じて改善された血管再生が心筋梗塞からの機能回復につながることを考えると、我々は、心筋梗塞の心臓へのhiPSC-ECの心筋内注射が心機能を促進する可能性があるという仮説を立てた。 続いて、連続心エコー検査を実施して、左心室（LV）機能とPRE（MI後1週間、細胞治療前）および細胞治療の2、4、および8週間後からの心臓リモデリングを評価しました。 この研究では、MI 患者の臨床状況を可能な限り再現するために、MI 誘発の 1 週間後に細胞を移植する MI モデルを採用しました。 心エコー検査の結果、すべての実験グループの駆出率（EF）と短縮率（FS）の両方が、介入を受けなかった偽グループと比較して有意に低いことが実証されました。 （補足図2a〜g）。 重要なことに、hiPSC-ECを受けた心臓は、細胞処理後8週間までMI対照群よりも有意に高いEFおよびFSを示しました（図1c〜d）。 左心室拡張期内部寸法 (LVIDd)、左心室収縮期内部寸法 (LVISd)、中隔壁厚さ (SWT)、後壁厚さ (PWT)、および相対壁厚さ (RWT) など、心臓リモデリングのいくつかのパラメータのうち、 hiPSC-EC処理心臓におけるLVIDdおよびLVIDsは、MI対照心臓のものよりも有意に低く、hiPSC-ECが有害な心臓リモデリングから心臓を保護していることを示している。 (図1e-iおよび補足図2h)。 同様に、細胞処理後 8 週間で採取した心臓組織を用いて得られたマッソントリクローム染色の結果は、hiPSC-EC 注射群の線維化領域 (%) がかなり小さく、生存心筋 (%) が大きいことを示しました。 MI対照群のそれ（図1j–m）。 これらの結果に基づいて、我々は、hiPSC-EC が MI に曝露された心臓における in vivo の新規血管形成に直接寄与し、その結果心機能の向上をもたらすことを確認した。

続いて、我々は、血管新生と血管新生の両方を同時に誘導することが、MI心臓における包括的な血管再生と機能改善につながるかどうかという中心仮説を調査した。 我々は、hiPSC-ECがMIの心臓で血管形成に成功したことをすでに検証しているため、宿主の心臓の血管から相補的な血管形成を誘導できる追加の細胞源を特定しようと努め、最終的に、次のように操作された遺伝子改変ヒト間葉系幹細胞をテストすることにしました。ヒト SDF-1α タンパク質 (SDF-eMSC) を継続的に放出します23。 SDF-eMSC は通常の BM-MSC と区別できませんでした。 SDF-eMSCは、hMSCを代表する均質な紡錘形の細胞形態を示しました（補足材料と方法、補足図3a）。 SDF-eMSCは、正常なBM-MSCと比較して、培養時間中の集団倍加レベル（PDL）の段階的な増加に基づいて、高い増殖能を持っていました24（補足図3b）。 SDF-eMSCは、CD34、CD11b、CD19、CD45およびHLA-DRの発現なしで、CD90、CD44、CD105およびCD73などのヒトMSCに特異的ないくつかのマーカーを発現しました（補足図3c）。 ヒトSDF-1α酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）分析によって決定されたように、SDF-eMSCはヒトSDF-1αタンパク質を安定に分泌した（補足図3d）。 SDF-eMSCの核型分析の結果は、染色体異常のないSDF-eMSCの正常なヒト核型を明らかにし、SDF-eMSCの遺伝的安定性を示唆しています（補足図3e）。

SDF-eMSC が EC の血管新生の可能性を増強できるかどうかを調べるために、SDF-eMSC を使用してさまざまなタイプの in vitro 実験分析を実行しました。 まず、SDF-eMSC が EC および血管新生特性に関連する遺伝子発現に影響を与えるかどうかを判断するために、培養 SDF-eMSC または BM-MSC から採取した 30% 馴化培地 (CM) を培養 hiPSC-EC に 3 日間処理しました。 qRT-PCR分析を実行しました。 間質由来因子 1 アルファ (SDF-1α)、Ig を持つチロシンキナーゼ、上皮成長因子相同ドメイン 2 (Tie-2)、vWF、E-セレクチン (CD62)、および細胞間接着分子 1 の発現レベル ( ICAM-1）は、BM-MSC-CMに曝露されたhiPSC-ECよりも、SDF-eMSC-CMで処理されたhiPSC-ECの方が有意に高かった（図2a）。 特に、E-セレクチンとICAM-1の発現増加は、活性化されたECの存在下での血管新生に関与することが知られています25、26、27、28、29。 次に、EC 遊走アッセイでは、図 2 に示すように、SDF-eMSC からの馴化培地 (SDF-eMSC-CM) を添加すると、hiPSC-EC または HUVEC の遊走が、SDF-eMSC で処理した EC の遊走と比較して有意に増強されました。ヒト骨髄由来MSC（BM-MSC-CM）からのCMは、SDF-eMSCから放出されたサイトカインがECの可動性を強化することを示唆しています（図2bおよび補足図4a）。 さらに、SDF-eMSCがECの血管形成能を直接促進するかどうかをテストするために、細胞の血管形成能を評価する代表的な実験であるマトリゲル管形成アッセイを実施しました。 マトリゲル管形成アッセイの結果は、hiPSC-EC と培養 SDF-eMSC から採取した 30% CM で処理した HUVEC の両方で形成された分枝の数が、BM-MSC-CM で処理した EC よりも有意に多いことを実証しました。 (図2cおよび補足図4b)。 興味深いことに、SDF-eMSC-CM による処理は、hiPSC-EC による管形成を促進するだけでなく、hiPSC-EC から形成された血管の維持にも寄与しました。 BM-MSC-CMに曝露されたhiPSC-EC生成血管は血管形成後24時間以内に血管構造を破壊し始めたが、SDF-eMSC-CMによる処理は最長48時間血管の完全性を維持した。

培養骨髄間葉系幹細胞 (BM-MSC-CM) または SDF 操作 MSC (SDF-eMSC- CM）3日間。 y 軸は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) に対する標的遺伝子の相対的な mRNA 発現を表します。 n = 3。 *p < 0.05。 b EC遊走アッセイ。 移動した hiPSC-EC の代表的な画像と移動した領域の定量化 (%)。 hiPSC-EC をトランスウェル (上) に配置し、通常の培地 (EGM、EBM) またはさまざまな細胞ソース (BM-MSC-CM および SDF-eMSC-CM) から収集した馴化培地 (CM) をトランスウェルに配置しました (下）7時間。 n = 3。 *p < 0.05。 c 管形成アッセイ。 hiPSC-EC は、Geltrex™ でコーティングされた 24 ウェル プレートで、通常の培地 (EGM、EBM) または馴化培地 (CM) (BM-MSC-CM および SDF-eMSC-CM) を使用して 9、24、または 48 時間培養されました。 。 管形成の代表的な画像と接合部の数の定量化の概要。 n = 3。 *p < 0.05。

SDF-eMSC-PAが常にSDF-1αをMI心臓に放出できる細胞リザーバーを提供するために、SDF-eMSCと2％心臓由来の脱細胞化細胞外物質を混合することにより、SDF-eMSCをカプセル化したパッチ（SDF-eMSC-PA）を作製しました。マトリックス（hdECM）ベースのバイオインクを使用し、それをポリカプロラクトン（PCL）メッシュにロードしました（図3および補足図5）。 その後、SDF-eMSC-PAが機能し、SDF-1αを効率的に放出できるかどうかを確認するために、SDF-eMSC-PAをin vitroで28日間培養し（補足図5a）、3日間のさまざまな時点で上清を収集して、 SDF-1α ELISA キットを使用した SDF1α-eMSC-PA の放出動態。 累積放出曲線は、0日目のSDF-1αの初期濃度がSDF-eMSC-PAよりもSDF-サイトカイン-PAの方が高かったにもかかわらず（300 ng/ml）、SDFではSDF-1αが検出されなかったことを示しました。ただし、SDF-eMSC-PAから放出されたSDF-1αの発現は21日目まで一貫して増加し（補足図5b）、SDF-eMSCがパッチ内でSDF-1αを継続的に分泌したことを示唆しています。

a 3D プリンティング システムによって生成されたポリカプロラクトン (PCL) プラットフォームを使用して、SDF 操作 MSC をカプセル化した心臓パッチ (SDF-eMSC-PA) を製造する手順。 b hdECM パッチ内の光学画像。 SDF-eMSC-PA は、追跡用に赤色蛍光色素 DiI で事前に標識されています。 スケールバー: 1 mm。 c MI誘発心臓の心外膜に移植されたSDF-eMSC-PAの画像。 d PA移植後8週間の心臓の肉眼図。

hiPSC-ECとSDF-eMSC-PAを使用した血管新生と血管新生の両方の同時誘導がMI誘発心臓の包括的な血管再生と機能改善につながるかどうかを最終的に判断するために、5つの実験グループを形成した後、LAD結紮によってMIを誘発しました。 (1) MI コントロール、(2) MI 心臓の SDF-eMSC-PA 移植心外膜 (PA のみ、1 × 106)、(3) hiPSC-EC、心筋内注射 (EC のみ、1 × 106)、および(4) hiPSC-EC と SDF-eMSC-PA の組み合わせプラットフォーム (EC + PA、それぞれ 1 × 106) (図 4)。 まず、細胞処理前、2、4、および8週間後にすべての実験グループに対して連続心エコー検査を実施しました。 すべての実験グループは、偽グループと比較して大幅に減少しました（補足図6a〜g）。 興味深いことに、EC + PA グループの心機能は、治療前の心機能と比較して 8 週間まで有意に維持されましたが、コントロール、hiPSC-EC 単独グループ、SDF-eMSC-PA 単独グループなどの他のグループの心機能は、 8週間まで継続的に減少しました。 (図4a～d)。 LVIDd、LVIDs、SWT、PWT、およびRWTによって決定される有害な心臓リモデリングは、他のグループと比較してEC + PAグループで顕著に減少しました（図4e-iおよび補足図6h）。 さらに心機能をより正確に評価するために、左室の血行力学的圧力と容積を測定できる侵襲的圧力容積（PV）カテーテルを使用して左室血行力学的測定を実施しました。 細胞処理後 8 週間の PV ループの結果は、EC + PA グループが他のグループと比較して心臓機能を大幅に改善し、有害な心臓リモデリングを防止したことを示しました (図 5)。 一般的な心臓機能の 2 つのパラメーターである 1 回拍出量 (SV) と心拍出量 (CO) は有意に高く (図 5a-c)、最大値で測定された心臓リモデリング指数である最大容積 (V max) も有意に高くなりました。拡張期は、EC + PA グループの方が他のグループよりも有意に低かった（図 5d）。 最大収縮期で測定された最大圧力（P max）は群間で大きな差はありませんでしたが、収縮期の圧力変化を示す最大圧力変化率（dP/dtmax）と最小圧力変化率（dP/dtmin）は群間で有意な差はありませんでした。 LV/秒は、EC + PA グループで増加しました。 (図5e〜fおよび補足図7a)。 閉塞した下大静脈 (IVC) の時間的変動を使用して、負荷に依存しない固有の心臓収縮性を評価しました。 拡張機能障害がないことを示す拡張末期圧と体積の関係（EDPVR）はグループ間で差がありませんでしたが、心臓の収縮性を示す収縮末期圧と体積の関係（ESPVR）の傾きは大幅に改善されました。 EC + PAグループと他のグループとの比較（図5g〜hおよび補足図7b）。 まとめると、LV 血行動態測定からのこれらの結果は、hiPSC-EC と SDF-eMSC-PA を組み合わせたプラットフォームによる治療が MI 心臓の心臓修復を改善することを一貫して示しています。

a 左心室駆出率 (EF)。 b 細胞処理後 8 週間の EF デルタ変化。 c 左短縮率（FS）。 d 細胞処理後8週間のFSデルタ変化。 e 左心室拡張期内部寸法 (LVIDd)。 f 左心室収縮期内部寸法 (LVID)。 g 中隔壁の厚さ（SWT）。 h 後壁の厚さ (PWT)。 i 相対壁厚 (RWT)。 n = 6–11。 *p < 0.05。

a 細胞処理後 8 週間の定常状態での血行力学的圧力および体積 (PV) 曲線の代表的な画像。 b 一回拍出量（SV）。 c 心拍出量（CO）。 d 拡張末期における LV 内の血液量を定義する最大容量 (V max)。 dP/dtmax は、収縮期中の圧力変化の最大速度を指します。 f 拡張期中の圧力変化の最小速度 (dP/dtmin)。 g 一過性の下大静脈（IVC）閉塞によって測定された固有の心臓収縮性を示す収縮終期圧容積関係の傾き（ESPVR）。 h 拡張末期圧容積関係の傾き (EDPVR)。 n = 4。*p < 0.05。

次に、SDF-eMSC-PAの存在下または非存在下で、心筋内に移植されたhiPSC-ECの生体内挙動を調査しました。 hiPSC-EC は常に GFP を発現しているため、心臓組織切片での運命を追跡することができました。 細胞処理後 8 週間で採取した心臓組織の共焦点顕微鏡検査により、SDF-eMSC-PA の移植により、心筋内に注射された GFP 陽性 hiPSC-EC の保持と生着が​​大幅に改善されることが実証されました。 定量的には、EC + PA グループにおける GFP 陽性 hiPSC-EC の割合は EC グループよりも大幅に高かった（図 6a）。 興味深いことに、hiPSC-EC 単独グループの hiPSC-EC は注射部位の近くに局在していましたが、EC + PA グループの hiPSC-EC は左心室の領域全体に分布していました。 注入されたhiPSC-ECの生存と保持を改善するSDF-eMSC-PAの能力を考慮して、我々はSDF-eMSC-PAがin vitroでhiPSC-ECに直接的な細胞保護効果を発揮するかどうかを調べようとしました。 虚血性損傷は、hiPSC-EC を H2O2 (500 μM) に曝露することによってシミュレートされました。 SDF-eMSC からの CM (SDF-eMSC-CM) の投与は、LIVE/DEAD アッセイおよび CCK-8 アッセイによって測定されたとおり、hiPSC-EC と HUVEC の両方の生存率を大幅に改善しました（補足図 8a-f）。 SDF-eMSC-CMによる処理により生存細胞の数が実質的に増加したことは、SDF-eMSC-CMが虚血性傷害に対してECに対して直接的な細胞保護効果を及ぼすことを示唆している。 続いて、細胞処理の8週間後に採取した心臓組織を用いて徹底的な組織学的分析を実施し、SDF-eMSC-PAがhPSC-EC依存性の血管新生と宿主血管の血管新生を同時に促進できるかどうかを調べました。 これらの実験では、機能的な内皮を同定するために、ローダミンと結合した IB4 を全身注射しました。 当初、共焦点画像は、EC + PA グループの心臓の境界領域と梗塞領域の両方における総 IB4 陽性 (IB4+) 毛細血管の数が、EC グループを含む他のグループよりも大幅に多いことを実証しました (図.6b）。 GFP陰性だがIB4陽性である血管（GFP-/IB4+）の数も、ECのみのグループを含む他のグループよりも有意に多かった（図6c）。 これらの結果は、組み合わせたアプローチが MI 心臓における宿主血管の血管新生を有意に促進したことを示唆しています。 さらに重要なことに、hiPSC-EC-GFP+によって新たに形成された血管の数は、ECのみのグループよりもEC+PAグループの方が大幅に多く、SDF-eMSC-PAがhiPSC-EC依存性の血管形成を促進することが示されました（図1）。 6d〜eおよび補足図9a）。 特に、機能血管の指標の 1 つである太い血管の数 (直径範囲: >5 μm) は、EC + PA 群の方が EC 群よりも有意に多かった。 興味深いことに、EC + PA グループの大きな血管の多くは、平滑筋細胞のマーカーである α-SMA の豊富な発現を示し、これらの大きな血管 (CD31+/α-SMA+) が細動脈様血管である可能性を示唆しています。 SDF-eMSC-PAは、血管の内方成長と成熟において特定の役割を果たしました（図6e〜gおよび補足図9b）。

細胞処理後8週間の梗塞領域内のhiPSC-EC-GFPの代表的な画像とその定量化の概要。 n = 3。 *p < 0.05。 スケールバー: 1000 μm。 b 細胞処理後8週間の梗塞ゾーン（IZ）、境界ゾーン（BZ）、および遠隔ゾーンのIB4-ローダミン（赤）で染色された血管の代表的な画像とその定量化の概要。 n = 5 ～ 7。 *p < 0.05。 スケールバー: 100 μm。 c 梗塞領域におけるGFP陰性だがIB4陽性（GFP-/IB4+）の血管の代表的な画像とその定量化の概要。 hiPSC-ECs-GFP (緑)、IB4-ローダミン (赤)、および DAPI (青)。 n = 5。*p < 0.05。 スケールバー: 20 μm。 d、e 梗塞領域のGFPおよびIB4（GFP+/IB4+）陽性血管の代表的な画像とその定量化。 hiPSC-ECs-GFP (緑)、IB4-ローダミン (赤)、および DAPI (青)。 n = 5。*p < 0.05。 スケールバー: 20 μm。 f、g 梗塞領域および境界領域におけるhiPSC-EC由来のGFP陽性血管の直径。 n = 5。*p < 0.05。

複合プラットフォーム（EC + PA）によって達成された血管再生が虚血性発作から心筋を救うのに十分であるかどうかをさらに調査するために、すべての実験から採取した心臓組織を使用して心筋トロポニンT（cTnT）抗体の免疫染色によって生存可能な心筋を定量しました。細胞処理後8週間のグループ。 EC + PAグループにおける生存可能なcTnT + 心筋細胞の数は、他のグループよりも有意に多かった（図7a）。 心臓組織を使用した組織学的分析からのこれらの結果は、SDF-eMSC（補足図10a）がin vitroで虚血性傷害に対して心筋細胞に直接的な細胞保護効果を与えることができるかどうかをテストする動機になりました。 虚血性損傷は、心筋細胞を H2O2 (500 μM) に曝露することによってシミュレートされました。 LIVE/DEAD アッセイとコレシストキニン 8 (CCK-8) アッセイの両方の結果から、SDF-eMSC 馴化培地 (CM) の投与により、新生仔ラットから単離された培養心筋細胞 (NRCM) の H2O2 に対する生存率が大幅に向上することが実証されました。他の治療法と比較した治療法。 これらの結果は、SDF-eMSCが虚血性傷害に対して直接的な細胞保護効果があることも示唆しています（補足図11a〜c）。

a 細胞処理および cTnT 陽性心筋細胞の数の定量の 8 週間後に cTnT (緑色) および DAPI (青色) で染色された心筋の代表的な免疫染色​​画像。 心臓パッチ内で DiI で標識された SDF-eMSC (赤) n = 5。 *p < 0.05。 スケールバー: 300 μm。 b 細胞処理の8週間後に採取した心臓組織を使用したマッソントリクローム染色の代表的な画像。 c、d 線維症と生存心筋の割合の定量化の概要。 n = 5。*p < 0.05。 スケールバー: 2000 μm。

その結果、併用治療グループは心線維症の大幅な減少を示しました。 8週間で採取された心臓組織を使用したマッソントリクローム染色の結果は、線維症の領域（％）を示しましたが、これは他のグループよりも併用治療グループで有意に低かった（図7b-d）。 総合すると、我々の結果は、併用治療が血管再生の促進を通じて包括的な心臓修復をもたらし、SDF-eMSCが細胞保護性SDFサイトカインの一貫した分泌を介して虚血性損傷からの心筋の間接的保護に少なくともある程度貢献したことを明確に示唆した。

本研究では、おそらく出生後の血管新生と血管新生の両方を同時に誘導することにより、hiPSC-ECとSDF-eMSCを使用して効果的な治療的血管新生を達成するための多面的な戦略を開発しようとしました（図8）。 心筋内に注入されたhiPSC-ECは、出生後の血管形成メカニズムを介して新規血管の形成に成功する一方、心外膜に移植されたSDF-eMSC-PAは、MI心臓からの既存の宿主血管およびMI心臓から新しく形成された血管の血管新生を効果的に促進することを観察しました。注入されたhiPSC-ECは、血管新生促進サイトカイン、特にSDF-1αの継続的な分泌を介して起こります。

hiPSC-ECとSDF-eMSC-PAを組み合わせたプラットフォームにより、心機能の改善と包括的な血管再生が達成されます。

どうやら、SDF-eMSC-PAは、心筋内に注射されたhiPSC-ECに好ましい微小環境を提供し、虚血心臓におけるhiPSC-ECの生存、遊走、滞留を改善したようです。 さらに重要なことは、SDF-eMSC-PAは、hiPSC-ECによって形成された新規血管の原始状態から、より大きな機能的に灌流可能な血管へのその後の血管成熟を実質的に誘導したことである。 総合すると、hiPSC-EC と SDF-eMSC-PA のこれらの相乗効果により、最終的には MI に曝露された心臓における完全な血管再生が達成されました。 実際、これまでの多くの研究では、EPC、hMSC、心臓前駆細胞などの複数の細胞型を用いて、血管新生または血管新生のいずれかを個別に標的とした治療的血管新生が試みられてきました11、30、31、32、33。 以前の研究と比較すると、この研究は、我々の知る限りでは、2つの異なる経路を介して送達された2つの異なる主要な幹細胞タイプを使用することにより、血管新生と血管新生の両方を同時に誘導することにより包括的な血管新生を誘導した最初の研究である。

MI 心臓における出生後の血管形成を達成するために、我々は主に、血管形成能が比較的高く、内皮特異的遺伝子および構造タンパク質の発現、ならびに管形成などの生理学的特徴の点でヒト初代 EC と類似していることから、hiPSC-EC を採用しました。生体内での LDL の取り込みと毛細血管の形成。 いくつかの前臨床研究では、hPSC-EC を使用して宿主の毛細血管をうまく生着、整列させ、結合させて血管分布を増加させることができることが実証されています 34,35。 さらに重要なことに、hPSC-EC は後肢虚血モデルの灌流を回復し、創傷治癒を促進したため、血管疾患を治療するための理想的な細胞源となります 36、37、38。 hPSC-EC は、以前に調査された他の細胞型よりも比較的高い血管形成能を有することが示唆されているが、今回の研究および他の研究は、虚血領域に十分な数の新しい血管を生成するには、hPSC-EC のみによる治療では不十分である可能性があることを一貫して示しています。心筋梗塞の心臓は非常に過酷な環境にあるため、追加のサポートが必要であることが示唆されています。 したがって、hiPSC-EC に基づく血管新生を促進し、宿主血管からの血管新生を誘導するために、SDF-1α を持続的に放出するように遺伝子操作された SDF-eMSC をカプセル化することにより心臓パッチを作製しました。

SDF-1α は、細胞増殖、生存、遊走、血管新生、抗アポトーシス効果など、EC における複数の生理現象に密接に関与しているため、心筋血管新生の主要な誘導物質として選択されました 39,40。 それにもかかわらず、SDF-1α の治療上の使用は、半減期が短いため制限されています 41。 したがって、我々は、hTERT および c-Myc 再プログラミング因子をコードするレンチウイルス ベクターを使用して、SDF-1α の連続放出を促進するようにヒト BM-MSC を操作しました。 我々は、SDF-eMSCからのならし培地を培養hiPSC-ECおよびHUVECで処理すると、いくつかの血管新生関連遺伝子の発現の増強、ECの増殖、遊走および管形成など、血管新生の可能性が大幅に改善されることを実証しました。 損傷した心筋へのSDF-1αおよび他の好ましいパラクリン因子の持続的な分泌を確実にするために、梗塞領域内の細胞リザーバーとして機能するhdECM由来の心臓パッチを生成しました。 心臓パッチを設計するために、我々は、バイオインクとしてSDF-eMSCと混合した無細胞ECMの保存と輸送の容易さのために最適化された凍結乾燥ブタhdECMの調製を含む革新的な戦略を開発した。 我々の結果は、より多くのDiI陽性MSCによって証明されるように、SDF-eMSCは治療後8週間までパッチ内で良好に生存するようであることを示した。 生き残ったSDF-eMSCは、有益なパラクリン因子を常に分泌し、hiPSC-EC依存性の血管形成および血管新生を促進することによって血管再生を促進し、最終的に損傷した心筋を若返らせた。

実際、宿主心筋への移植後の著しい細胞死と低い生着率は、虚血心臓における細胞ベースの血管再生を制限する最も重大な障害の一部である。 興味深いことに、我々の組織学的分析により、心筋内に注射されたhiPSC-ECの保持と生着が​​大幅に増加し、心外膜SDF-eMSC-PAと組み合わせると強力で安定した血管再生が誘導されることが明らかになりました。 逆に、SDF-eMSC-PA が存在しない場合、hiPSC-EC の数は 8 週間にわたって急速に減少しました。 対照的に、その存在により、その後の血管形成のために生き残るhiPSC-ECの数が大幅に増加しました。 したがって、SDF-eMSC-PAによって分泌されるパラクリン因子は、最初は、注入されたhPSC-ECの急速な安定化を促進し、特に移植の初期段階でのhiPSC-ECの生存と生着を改善しました。 細胞ベースの血管再生の成功は、心臓内で生き残って生着する細胞の数に大きく依存するため、より高い生着率が特に重要です42。

さらに、SDF-eMSC-PA は血管の再生を促進するだけでなく、血管の拡大や、血管成熟の初期段階と定義できる機能的な血管への移行にも貢献します。 組織学的分析により、EC + PA グループの心臓では、梗塞領域と境界領域の両方において、生理学的および機能的に重要な直径が 5 μm を超える血管の数が、他の実験グループよりも大幅に多かったことが示されました。 hiPSC-EC単独グループを含むグループ。 追加の証拠として、in vitro マトリゲルプラグアッセイの結果は、SDF-eMSC 由来の馴化培地での処理が、未処理の対照血管と比較して、hiPSC-EC 由来の血管の完全性を 48 時間以上維持することを示唆しました。 さらに興味深いことに、SDF-eMSC-PA は、CD31 と α-SMA の両方に陽性の血管の数が EC + PA で有意に多かったため、おそらく平滑筋細胞の遊走と動員を刺激することによって血管の動脈化を誘導するようです。グループは他の実験グループよりも優れています。 まとめると、これらの結果は、SDF-eMSC-PA が血管の安定性と完全性に実質的に寄与していることを明確に示しています。

要約すると、我々は、hiPSC-ECとSDF-eMSC-PA誘導を介した虚血心臓における血管再生のための新しい戦略を提案します。これは、hiPSC-ECに基づく血管形成を促進するだけでなく、宿主梗塞心臓の血管新生も刺激します。 したがって、二重システムに基づく私たちの新しい治療戦略は、血管の再生と心臓の修復に使用できます。

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リファレンスをダウンロードする

この研究は、保健福祉部 (SHM の #HI20C0184)、韓国再生医療基金 (SJP の #21A0403L1 および JJ の #NRF-2021M3E5E5096524)、食品医薬品安全省 (HJP の #18172MFDS182) の支援を受けました。 ）およびバイオおよび医療技術開発プログラム助成金（HJP への #NRF-2017M3A9B3061954）。 この研究は、香港研究助成評議会 (21100818 から KB)、CityU 応用研究助成金 (ARG から KB)、および TFBC プロジェクト基金 (KB) によっても支援されました。

Hyeok Kim、Soon-Jung Park、Jae-Hyun Park の著者も同様に貢献しました。

韓国カトリック大学医学部生物医学健康科学科、ソウル、韓国

キム・ヒョク、パク・ジェヒョン、パク・ボンウ、ファン・ジウォン、キム・ジンジュ、シム・ウソプ、パク・フンジュン

韓国カトリック大学ソウル聖母病院内科循環器科（ソウル、韓国）

キム・ヒョク、パク・ボンウ、ファン・ジウォン、キム・ジンジュ、シム・ウソプ、パク・フンジュン

T&R Biofab Co., Ltd. 研究所、始興、韓国

パク・スンジョン＆ムン・ソンファン

香港城市大学生物医科学部、九龍塘、香港

パク・ジェヒョン、イ・ソンフン、バン・キウォン

SL BIGEN, Inc.、城南、韓国

イ・スンミン＆キム・ヒョジン

韓国、浦項市の浦項科学技術大学、創造 IT 工学部および学際生命科学および生物工学部

カン・ビョンミン＆チャン・ジナ

韓国カトリック大学医学部泌尿器科（ソウル、韓国）

チョン・スンファン

韓国ソウルのカトリック大学内科循環器科

キム・ドンビン

浦項科学技術大学機械工学科、浦項、韓国

チョ・ドンウ

韓国、原州、尚志大学動物バイオテクノロジー学部

ムン・ソンファン

韓国カトリック大学医学部細胞死疾患研究センター、ソウル、韓国

パク・フンジュン

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ムン・ソンファン、パク・フンジュン、またはバン・キウォンとの通信。

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転載と許可

キム、H.、パーク、SJ.、パーク、JH. 他。 デュアル幹細胞アプローチによる心筋梗塞後の効果的な血管再生のための強化戦略。 Exp Mol Med 54、1165–1178 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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受信日: 2021 年 12 月 7 日

改訂日: 2022 年 3 月 8 日

受理日: 2022 年 3 月 21 日

公開日: 2022 年 8 月 16 日

発行日：2022年8月

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-022-00827-8

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