ヒトのニューロンとマウスにおけるMYT1Lハプロ不全は自閉症を引き起こす

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MYT1L は、生涯を通じてほぼすべてのニューロンで発現される自閉症スペクトラム障害 (ASD) 関連の転写因子です。 MYT1L 変異がどのようにして神経学的表現型を引き起こすのか、またそれらを標的とすることができるのかは依然として謎のままです。 ここでは、ヒトのニューロンとマウスにおけるMYT1L欠損の影響を調べます。 変異マウスは、ASD患者のものと似た、より薄い皮質、行動表現型、および遺伝子発現の変化を伴う神経発達の遅れを示します。 WNT や NOTCH などの MYT1L 標的遺伝子は、MYT1L が枯渇すると活性化され、その化学的阻害により in vitro で遅延した神経新生を救済することができます。 MYT1L欠損はまた、主要な心臓ナトリウムチャネルであるSCN5Aの上方制御およびニューロンの活動亢進を引き起こすが、これは有糸分裂後ニューロンにおけるSCN5AのshRNA媒介ノックダウンまたはMYT1L過剰発現によって回復する可能性がある。 ナトリウムチャネル遮断薬であるラモトリジンを緊急に投与すると、インビトロでの電気生理学的欠陥やインビボでの行動表現型も回復した。 したがって、MYT1L 変異は、発生および有糸分裂後の神経学的欠陥の両方を引き起こします。 しかし、急性介入により、成人期に生じる電気生理学的表現型および行動表現型を正常化することができます。

自閉症スペクトラム障害 (ASD) は、社会的パターンの変化を含む行動の変化を特徴とする一般的な神経発達障害 (NDD) です [1]。 ASD は、てんかん、知的障害、多動性などの併発疾患と関連していることがよくあります。 神経伝達に影響を与える遺伝子変異は ASD のリスクを高め、治療標的となる可能性をもたらします [2]。 しかし、ASD の遺伝的不均一性は非常に大きく、最近では複数の転写制御因子がこのグループの疾患に関連していると考えられています。 実際、マウスモデルでは、Chd8 や Smarcc2 のような BAF 複合体メンバーなどのクロマチンリモデラーの変異が行動表現型を誘発する可能性があることが示されており [3,4,5,6]、ASD の潜在的な因果関係を示唆しています。 しかし、それらの疾患への寄与や臨床的関連性は依然としてとらえどころのないことが多く[7]、そのため、診断時の遺伝子調節因子関連精神障害に対する標的治療法の開発は制限されている[8、9]。

ASDと最も強く関連する91個のクロマチンまたは遺伝子調節因子(カテゴリー1; [10])のうち、MYT1Lは生涯を通してほぼすべてのニューロンで特異的かつ継続的に発現します[10、11、12]。 MYT1L は保存されたジンクフィンガー転写因子であり、知的障害、統合失調症、てんかん、ASD と診断された患者で変異が報告されており [13,14,15,16,17,18]、MYT1L を介した遺伝子制御が重要である可能性があることが示唆されています。 ASDを含むNDDの予防に。 実際、ヘテロ接合性 MYT1L 欠失または機能喪失型変異を有する現在報告されている症例の 98% (51 例中 50 例) が ASD および/または知的障害と診断されています [19]。 行動的特徴に加えて、MYT1L 変異を持つ数人の患者は、発達遅延、肥満、発作、脳奇形も示します [19]。 MYT1L は、過剰発現時に線維芽細胞を機能性ニューロンに直接再プログラムできる 3 つの元の因子のうちの 1 つです [20]。 MYT1L は、WNT や NOTCH などのいくつかの発達経路を積極的に抑制することにより、in vitro でニューロンの同一性を高めることができる転写抑制因子です。 これは、SIN3/HDAC などのエピジェネティックサイレンサーの採用によって部分的に達成されます [21、22、23]。 予期せぬことに、再プログラミング実験により、MYT1L が筋肉遺伝子や線維芽細胞遺伝子などのいくつかの非ニューロン遺伝子プログラムに結合して抑制することも明らかになり、他の系統特異的遺伝子を沈黙させる汎ニューロンのセーフガードとしての役割が示唆されている[21、24、25]。 実際、最近の研究では、Myt1l エクソン 15 のフレームシフト変異またはエクソン 9 の欠失によって引き起こされる Myt1l ハプロ不全が、マウスの脳発達と行動表現型の変化を誘発することが記載されています [26、27]。 しかし、多くの重要な疑問は未解決のままです。 たとえば、患者の報告に基づいて示唆されているように、異なる MYT1L 変異が表現型の重複を引き起こすかどうかは不明です。 さらに、ヒトのニューロンにおけるMYT1L枯渇の影響を示す研究はありません。 最後に、神経学的表現型を引き起こす分子機構、およびそれらが介入に適しているかどうかは不明です。

ここでは、遺伝子操作マウスとヒト誘導ニューロンを使用して、発生中のMYT1Lの役割を調査し、MYT1L関連NDDを研究するための新しい前臨床プラットフォームとして研究しました。 これらの翻訳モデルを使用して、MYT1L欠損は、遺伝子発現の調節解除や神経新生の遅延から皮質の菲薄化や行動の変化に至るまで、自閉症に関連する表現型を誘発するのに十分であることを示します。 WNT および NOTCH 調節因子を含む MYT1L 標的遺伝子は、ヒトニューロンにおける MYT1L 枯渇の早期に活性化され、化学経路阻害により関連する分化欠陥を救済できる可能性があります。 われわれは、MYT1Lの喪失が心臓ナトリウムチャネルSCN5Aなどの非ニューロン遺伝子の上方制御も引き起こし、予期せぬニューロンネットワークの活動亢進を引き起こすが、これはMYT1Lの過剰発現やSCN5Aのノックダウンによって回復できることを発見した。 さらに、承認薬ラモトリジンを緊急に投与すると、有糸分裂後のマウスとヒトのニューロンの電気生理学的表現型と成体マウスの行動表現型が回復し、MYT1L 症候群患者に潜在的な治療手段が提供されました。

サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。 反復および統計分析を含むすべての値は、補足表S2〜8、13で利用できます。インビトロ分析用の細胞はランダムに選択され、マウスは治療グループにランダムに割り当てられました。 研究者らはパッチクランプ記録については盲検化され、他の実験は無作為化されなかった。

MYT1L 喪失をモデル化するために、Myt1l エクソン 6 に 7 bp のフレームシフトを持つマウスの生殖細胞系列変異を生成しました。さらに、ヒト ESC で条件付きヘテロ接合性 MYT1L 対立遺伝子を操作し、ヒト ニューロンで cre を介したエクソン 7 の除去を可能にしました。 我々は、ヒトおよびマウスのニューロンにおいて全長 MYT1L タンパク質の予想された減少を観察しました。 変異マウスにおいて、核局在化と機能を欠く切断型 MYT1L タンパク質アイソフォームを発見し、機能喪失モデルの妥当性を確認しました。

P0 マウスの 1 つの半球を液体窒素中で急速冷凍し、以前に記載されているように各 MYT1L 免疫沈降に使用しました [21]。 結合したタンパク質を酵素的に消化し、ペプチドを質量分析分析 (Fusion Orbitrap; Thermo Fisher Scientific) によって分析しました。

マウス グリア細胞は、ここに記載されているように [21]、P0 で野生型 CD1 (Jackson Laboratories) の前脳から単離されました。 神経細胞の初代培養では、以前に発表されたように、P0 Myt1l 変異体または対照マウスの子犬の海馬または皮質を単離しました [28]。 過剰発現またはノックダウンについては、インビトロ 3 日目 (DIV3) に、示された構築物をコードするレンチウイルスを細胞に形質導入しました。

ヒトのニューロンの生成については以前に説明されています[29]。 WNT および NOTCH 阻害は、1 日目から 4 日目まで培地に 10 μM N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-1-アラニル]-S-フェニルグリシン t-ブチル エステル (DAPT; Sigma) を補充することによって実行されました。 、15 μM テトラヒドロ-2-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-4H-チオピラノ[4,3-d]ピリミジン (XAV939; Santa Cruz)、またはその両方。 機能成熟のために、神経細胞をマトリゲルでコーティングしたカバースリップまたはPEIラミニンでコーティングしたMEAプレート（Axion）に初代マウスグリアとともに播種し、1週間2日ごとに培地を交換しました。 以下の培地交換は、実験期間中 3 ～​​ 4 日ごとに実行されました。

時限妊娠雌に、Ｅ１４．５でＥｄＵ（体重１ｋｇ当たり３０ｍｇ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を腹腔内注射した。 20時間後、胎児の脳を採取した。 Q フラクション分析は、以前に確立された手法に従って行われました [6]。 TBR2+ 細胞と SOX2+ 細胞の数は、社内で開発されたフィジー マクロを使用して、皮質中央部の幅 265 μm のセグメントで測定されました。 すべての定量化は、遺伝子型間の同等の前後位置で実行されました。

皮質の厚さの分析では、向きを決める皮質下の解剖学的ランドマークを使用して、遺伝子型全体にわたって P0 脳切片を整列させ、厚さを背側正中線から 45°の角度で測定しました。 培養ニューロンの形態解析は、SNT プラグインを使用してフィジーで実施されました [30、31]。 核内 FLAG-MYT1L 局在化は、DIV 3 で示された構築物の過剰発現に応じて、DIV 11 の初代マウス ニューロンで実行されました。

マウスは、12 時間の明暗サイクルで維持された温度制御された飼育室に収容され、試験は明サイクル中に行われました。 手順はハイデルベルク大学の学際的神経行動コアで実施され、カールスルーエの Regierungspräsidium (G-287/20、G-105/16) によって承認されました。

RNA 配列決定ライブラリーは dUTP プロトコル [32] に従って調製され、リードは STAR [33] を使用して hg38 または mm10 にマッピングされ、差次的発現は DESeq2 [34] (R パッケージ バージョン 1.28.1) とサイズ係数正規化および Wald を使用して決定されました。有意性テスト。 単一細胞 RNA-Seq 実験では、P0 マウスの前頭前皮質を抽出し、単一細胞に分離し、以前に公開されたプロトコル [36] に従って ECCITE-Seq [35] スキームに従ってバーコード化しました。 ライブラリーの調製には、Chromium Single Cell 5' v1 試薬キットを使用しました。 ライブラリーは、NovaSeq 6000 (Illumina) を使用して配列決定されました。 データは、10x Genomics Cell Ranger (バージョン 4.0.0) [37]、Seurat (バージョン 4.0) [38]、および Scanpy (バージョン 1.6.0) [39] で分析されました。 Myt1l 変異の影響を最も受けた各細胞型の部分集団は、パラメーター Beta = 31 および KNN = 5 を使用した MELD (バージョン 1.0) [40] を使用して特定されました。細胞型比の有意な変化は、正規化された細胞に基づくブートストラップ法 [41] を使用して特定されました。数値 (FDR < 0.01 および abs(Log2FC) > 1)。 Seurat の FindMarkers 関数内の MAST (バージョン 1.16.0) [42] を使用して、これらの部分集団に対して差次的発現を実行しました (logfc.threshold = 0、min.pct = 0.05、他のすべてのパラメーターはデフォルト)。 シーケンスリードは NCBI GEO GSE171327 で利用できます。

E18.5、P0および3ヶ月齢のマウスの前頭前皮質を準備し、初代培養調製のためのプロトコールに従って単一細胞を調製した。 公開されているプロトコールを使用して、動物あたり 300,000 個の細胞を CUT&RUN に使用しました [43]。 ライブラリーはNEBNext DNA Library Prep Kitで調製し、NextSeq 2000 (Illumina)で配列決定しました。 データは、nf-core/cutandrun パイプライン v1.0 (https://doi.org/10.5281/zenodo.5653535) を使用して分析されました。 Homer findMotifsGenome.pl は、パラメータ -size −75,75 -mask -mknown および MYT1L モチーフ AAAGTTW (http://homer.ucsd.edu/homer/) を使用してピーク ファイルに対して実行されました。

生後 4 ～ 6 週目のマウスを使用して海馬の横断スライスを作成し、以前に記載されているようにパッチを適用しました [44]。 自発的 EPSC 測定では、錐体細胞を、以下 (mM) を含む K+ ベースの内部溶液で -70 mV に電圧固定しました: 130 K-グルコン酸、10 Na-グルコン酸、10 HEPES、10 ホスホクレアチン、4 NaCl、4 MgATP、0.3 GTP、0.5% ビオシチン。 自発的 IPSC 測定では、推定錐体細胞を、以下 (mM) を含む Cs+ ベースの内部溶液で 0 mV に電圧固定しました: 126 Cs-グルコン酸塩、4 Cs-Cl、10 HEPES、10 ホスホクレアチン、4 MgATP、0.3 CNQX (10 μM) および D-APV (50 μM) の存在下での GTP および 2.5 QX-314。 DIV11 での初代海馬培養における興奮性シナプス電流の記録は、0.5 μM テトロドトキシン (TTX) の存在下または非存在下で、ここに記載されているように [21] 実行されました。

MEA 測定は、Axis Navigator ソフトウェアおよび 48 ウェル プレート (すべて Axion Biosystems 製) を備えた Maestro Pro マルチウェル デバイスを使用して実行されました。 急性治療の場合、ウェルごとに 10 μM ラモトリジン (Targetmol) を添加し、治療前と治療 2 時間後にプレートを測定しました。 データはmeaRtools [45]を使用して分析されました。

MYT1L 変異が複雑な神経発達欠陥を引き起こす可能性があるかどうかを検討するために、Myt1l のエクソン 6 に 7 bp の欠失を持つマウス モデルを作成しました (補足図 S1A–F)。 このフレームシフト変異は、ヒト MYT1L の aa 75 にナンセンス変異を持つ患者と同様に、アミノ酸 (aa) 78 に未熟な STOP コドンを誘導します [15]。 得られた子孫は、（+/+）対照と比較して、全長MYT1Lタンパク質の予想された減少を示しました（図1Aおよび補足図S1G、H）。 ただし、切断された MYT1L アイソフォームを検出しました。これは、aa 99 の内部メチオニンから発現された可能性が最も高いです (補足図 S1G、I) (補足表 S1)。 このアイソフォームは、核局在化シグナルの欠如により核への移行に失敗したため、機能しないと予想されます（補足図S1J、K）。 Myt1l (+/-) マウスは生存能力があり、繁殖力がありますが、ホモ接合型 Myt1l (-/-) 欠失により出生後に致死性が生じました (図 1B)。 これは、MYT1L が生存に不可欠であることを示しており、機能喪失モデルが検証されました。

Myt1l のエクソン 6 (エクソンをコードする最初のタンパク質) に CRISPR 誘発 7 bp フレームシフト生殖系列変異を有するマウスの出生後の脳溶解物中の MYT1L 全長タンパク質レベルをコントロールに対して正規化しました。 示された抗体を使用した代表的なウェスタンブロット画像を示します。 n ≥ 6。B 出生時の (+/−) x (+/−) 子孫からの生存円グラフ (8 同腹子 P0; n = 12 (+/+、黒)、31 (+/−、青緑)、15 ( −/−、黄色））および離乳後（7同腹のP21; n = 15（+/+）、17（+/-）、0（-/-））は、ホモ接合型Myt1l変異体が出生後に死亡することを示した。 C 出生時の前頭前皮質の単一細胞 RNA-Seq、および MELD を使用した特定の細胞型の集団における MYT1L 欠損 (+/-) および対照 (+/+) 細胞の濃縮が観察される可能性。 D [77] の参照データに基づいて注釈が付けられた、指定された細胞タイプにおける MYT1L 欠損 (+/-) 細胞と対照 (+/+) 細胞の比率。 * FDR < 0.01 & abs(Log2FC) > 1。 E 示された細胞タイプおよび MELD クラスターにわたる Myt1l (+/-) および (-/-) 変異により調節解除された遺伝子の数。 MYT1L 欠損によりダウンレギュレートされる (青) またはアップレギュレートされる (赤) 遺伝子が示されており、絶対 log2 倍率変化 > 0.1 および p-adj < 0.05 を示します。 F P0 で CUT&RUN によって決定された、野生型マウスの前頭前野における内因性 MYT1L のゲノム全体の占有プロファイル (n = 3)。 G 円グラフは、注釈付きのゲノム領域で検出された MYT1L 結合部位の分布を示します。 H MYT1L DNA 結合モチーフ (AAAGTT) は結合部位で大幅に濃縮されています。 I コントロールと比較した、Myt1l 欠失時の示された単一細胞集団のゲノム (すべて) および MYT1L 標的遺伝子 (転写開始部位から CUT&RUN ピーク ± 5 kb) における遺伝子発現変化のボックス プロット。 scRNA-Seq の場合、Myt11 では n = 2 (-/-; 10503 細胞)、(+/-; 13688 細胞)、および (+/+; 12072 細胞)。 棒グラフは平均値を示し、個々の動物からのデータポイントが表示されます。エラーバー = SEM、パネル A では対応のない t 検定、パネル I ではマン・ホイットニー検定、****p < 0.0001。

細胞組成と遺伝子発現の変化を調査するために、出生時の前頭前野の単一細胞RNA配列決定（scRNA-Seq）を実行しました（図1C〜Eおよび補足図S2）（補足表S2）。 新しい細胞クラスターの消失または出現は観察されませんでしたが、MELD [40]を使用して、各細胞が対照細胞または変異細胞のいずれかが豊富な近隣に存在する可能性を計算することにより、Myt1l変異体特異的な部分集団を特定しました（図1Cおよび補足）図S2C、D）。 変異マウスと対照マウスの間では細胞型比のわずかな変化のみが発生しましたが（図1Dおよび補足図S2E）、脳室下帯（SVZ）で新しく形成された遊走ニューロンをマークするTbr2細胞およびSema3c細胞集団の数が少ないことがわかりました。 。 さらに、Cdca7+介在ニューロンは(-/-)マウスで減少したが、皮質層Iニューロン(Reln+)は増加した。 差次的に発現された遺伝子の分析により、MYT1L の枯渇により、ホモ接合変異体でより顕著な全体的な遺伝子の上方制御がもたらされることが示されました (図 1E)。 皮質層ニューロンであっても、MYT1L枯渇により多くの非ニューロン遺伝子プログラムの発現増加が観察されました（補足図S2F）。 MYT1L標的遺伝子を特定するために、胎生期（E）E18.5日目、生後（P）0日目（P0）および3か月（成体）で野生型マウスでCUT＆RUN [43]を実行しました（図1F、Gおよび補足図） .S2G、H) (補足表 S3)。 我々は、結合部位の大きな重複と、さまざまな発生段階でのMYT1L DNA結合モチーフ（AAAGTT）の濃縮を発見しました（図1Hおよび補足図S2I、J）。 P0でMYT1L標的遺伝子と調節解除された遺伝子を交差させると、Satb2またはFezf2皮質細胞集団などのさまざまなニューロン集団内での有意な上方制御が明らかになりました（図1Iおよび補足図S2K）。 これは、転写抑制因子としてのMYT1Lの役割を強調し、ニューロンの同一性の誘導にもかかわらず、Myt1l変異細胞が不適切な遺伝子発現プログラムをサイレンシングできず、生体内でニューロンの転写同一性の混乱を引き起こしていることを示唆している。

MYT1L は、Notch や Wnt などの神経新生の負の制御因子 [21] を抑制することにより、in vitro でニューロンの同一性を高めることができ、制御不全になるとニューロンの分化ダイナミクスや脳構造に影響を与える可能性があります。 したがって、増殖マーカー Ki67 の同時染色と並行して EdU パルスチェイスを実行し、20 時間にわたって細胞周期を終了した皮質細胞の終了 (Q) 割合を決定しました。 実際、Ki67-EdU+ 細胞は大幅に減少し、E15.5 の Myt1l (-/-) 胚における Q 画分の約 37% の減少に対応しました (図 2A)。 SOX2+ 神経幹細胞と TBR2+ 神経前駆細胞は E15.5 で変化しませんでした（補足図 3A）。 出生時、Myt11 (+/-) および (-/-) マウスでは SOX2+ 幹細胞が増加しましたが (図 2B)、TBR2+ 前駆細胞は変化しませんでした。 これは、出生後に幹細胞プールを増加させ、皮質を薄くするNOTCHエフェクターHes1の過剰発現を模倣しています[46]。 したがって、Myt1l変異マウスの脳の解剖学的構造を研究したところ、出生時に脳全体のサイズは変化していませんが、脳の重量は減少し、その結果、長さと重量の比が増加したことがわかりました（図2Cおよび補足図S3B、C）。 さらに、皮質は対照よりもそれぞれ〜10％（+/-）または〜15％（-/-）薄かった（図2Cおよび補足図S3C）。 これらの結果は、抗神経新生プログラムの抑制に失敗すると神経新生が損なわれ、その結果、脳の構造的異常が引き起こされる可能性があり、一部の患者に見られる脳奇形の説明となる可能性があることを示唆している[19]。

E14.5で20時間パルスした後のEdU+細胞の代表的な画像と定量化、およびMyt11の皮質脳室帯（VZ）および脳室下帯（SVZ）におけるQ分率（すべてのEdU+細胞に対するEdU+Ki67-の比率）（+ /+、黒）、（+/-、青緑）および（-/-、黄色）E15.5 マウス。 IZ 中間ゾーン、n ≥ 5、スケール バー 100 μm。 B 皮質全体の同じ領域にわたるP0での(+/+)対照と比較した、Myt1l(+/-)および(-/-)マウスの皮質におけるSOX2+またはTBR2+細胞の定量。 示された抗体で染色された心室および心室下帯の拡大の代表的な画像が示されている。 n ≥ 4、スケールバー 50 μm。 C P0 における Myt1l (+/+)、(+/-)、および (+/-) 脳の構造。 NeuN で染色した代表的な切片と、脳重量で正規化した皮質の絶対厚さと皮質の長さの定量化を示します。 皮質の長さの場合は n ≥ 5。 皮質厚さの n = 3 のセクション、スケール バー 500 μm。 棒グラフは平均値を示し、個々の生物学的複製からのデータポイントが表示されます。エラーバー = SEM、一元配置分散分析 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。

次に、E18.5（マウス脳におけるMyt1l発現のピークと一致します（補足図S1A [11]））、P0のマウス皮質のバルクRNA-Seqを使用して、脳の発達全体にわたる分子レベルでのMYT1L欠損の影響を調べました。 （誕生）、P22（幼体）、および 3 か月（成体）。 数百の遺伝子が差次的に発現し、発達の初期（E18.5およびP0）および後期（P22および成人）に調節解除された遺伝子の異なるクラスターがあることがわかりました（図3Aおよび補足図S4A）（補足表S4）。 調節解除された遺伝子の多くは、以前にアノテーションが付けられたMYT1Lターゲット[21]またはMYT1L CUT&RUNターゲット（図1Fおよび補足図S2G）と重複せず、バルクサンプルにおける多くの変化が間接的であることを示唆しています。 ヘテロ接合性の脳サンプルでは、​​MYT1L標的遺伝子は上方制御と下方制御の両方でしたが、直接的なMYT1L標的遺伝子の約60％がホモ接合性Myt1l変異により上方制御されました（補足図S4B）。 これは、単一細胞分析に基づく（+/-）および（-/-）皮質ニューロンにおけるMYT1L標的遺伝子の上方制御と一致しており（図1E）、MYT1Lが主にニューロンの発達中にリプレッサーとして機能することを示唆しています。 E15.5でのQ画分の減少に応じて、E18.5での遺伝子発現は、神経発生に関連するGOタームの下方制御および細胞分裂の上方制御を明らかにした(図3B)。 さらに、E18.5で初期胎児の遺伝子発現サインの上方制御とそれに伴う後期胎児サインの減少が観察されました[47]（図3Cおよび補足図S4D）。 これは、他の ASD マウスモデル [5] で観察されたように、MYT1L 欠損が脳の発達の遅れを引き起こすことを示唆しています。 成体マウスのMyt1l変異によるニューロンのGO用語の下方制御の継続と、シグナル伝達および非ニューロン用語の増加が観察されました（図3Bおよび補足図S4C）。 遺伝子セット濃縮分析（GSEA）では、上方制御された遺伝子の中のいくつかの非神経細胞運命の特徴が強調され、Myt1l 変異脳の調節解除された遺伝子のうち、てんかん、統合失調症、ASD に関係する遺伝子が全体的に濃縮されていることを示した [48、49]（補足図S4D、E）。 興味深いことに、Myt1l エクソン 6 変異を持つマウスは、Chd8 ハプロ不全マウス [6] と重複する遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを示しましたが、最近発表されたエクソン 15 [26] およびエクソン 9 [27] Myt1l 変異マウスとは部分的にのみ重複しました（補足図） .S4F）。 最後に、ASD患者で上方制御される遺伝子はMYT1L欠損マウスでも上方制御され、Myt1l変異マウスで下方制御される遺伝子はASD患者でも下方制御されることを発見しました[5、50]（図3Dおよび補足図S4G）。 全体として、我々のデータは、ASD患者で観察されたように、マウスのMYT1L欠損が神経発達の遅延と遺伝子発現の調節解除につながることを示しています。

すべての複製およびステージにわたる、Myt1l 変異による調節解除された遺伝子のヒートマップ (遺伝子ごとにスケール) (行)。 B 発生中の指定の時点で対照と比較して、マウス皮質における Myt1l 変異により下方制御 (青) または上方制御 (赤) された遺伝子の選択された上位遺伝子オントロジー (GO) タームと p 値。 C GSEA プロットは、E18.5 の Myt1l 変異脳で調節解除された遺伝子のうち、胎児中期 (青) の神経発達関連遺伝子セットの減少と胎児初期 (赤) の濃縮を示します。 NES、正規化されたエンリッチメントスコア。 FDR、誤検出率。 D E18.5およびP22におけるマウス皮質におけるMyt11突然変異により上方制御または下方制御される遺伝子と、GeneOverlapによって決定されたASD患者の脳において上方制御または下方制御される遺伝子との重複。 RNA-Seq 解析の場合、n ≥ 5 E18.5、(+/+、黒色)、(+/-、青緑)、(-/-、黄色) の n ≥ 4 P0。 n = 6 P22、(+/+) および (+/-) の場合、それぞれ n ≥ 3 成人。 E オープンフィールド試験は、Myt1l (+/-) 変異体が P23 で対照動物と比較してより多くの距離をカバーし、中心領域でより多くの時間を費やしたことを示した。 3 つの独立したコホートからの (+/+) の場合は n = 25、(+/-) の場合は n = 29。 F ソーシャルチャンバー実験では、Myt1l (+/-) 変異体が生後 1 ヶ月の対照マウスと比較して、新規マウスの探索に費やす時間が雄特異的に減少することが示された。 3 つの独立したコホートからの (+/+) および (+/−) については n = 10。 棒グラフは平均値を示し、個々の動物からのデータポイントが表示され、エラーバー = SEM、マンホイットニー検定 **p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001、NS は有意ではありません。

次に、Myt1l マウス モデルを使用して行動分析を実行しました。 出生後早期のMYT1L欠損マウスでは発声が増加する傾向が観察されましたが、分析された鳴き声の数と種類は大幅に変化しませんでした（補足図S5A）。 数人のMYT1L患者で報告された活動亢進の表現型[13、14、15、16、51、52]と一致して、ホームケージ内の成体マウス、およびオープンフィールドおよび高架十字迷路内の幼体マウスの運動量の増加が観察されました。テスト（図3Eおよび補足図S5B–D）。 変異マウスは、後者の 2 つのテストにおいて、それぞれ中央領域とオープンアームで約 70% 多くの時間を費やしました。 さらに、探索的な立ち上がり行動は、変異マウスでは大幅に増加しました（補足図S5D）。 これは、MYT1L欠損マウスは不安が少ないことを示しており、この表現型は他のASDマウスモデルで報告されている[53、54]。 また、大理石の埋め込みとグルーミングイベントの大幅な減少も観察されました。これは、反復行動を評価するために使用されますが、不安様行動の減少も表します（補足図S5D、F）。 最後に、Myt1l 変異マウスの社会的行動を調査するために、社会室実験を実施しました。 すべての動物は、空のチャンバーとは対照的に、よく知っている同腹子のいるチャンバーを調査するという予想通りの好みを示しました。 ただし、野生型マウスと雌のMyt1l変異マウスの両方が、新しく追加された見慣れないマウスと一緒にチャンバーを探索するのにより多くの時間を費やしましたが、MYT1L欠損雄は、社会的新規性に対するこの予想される選好を示さなかった（図3Fおよび補足図S5E）。 要約すると、Myt1l の枯渇は、雄と雌のマウスで見られた多動性や雄特有の社会的欠陥など、ASD 関連行動のモデル化に使用されるテストでいくつかの顕著な行動変化を引き起こします。

ヒトニューロンにおけるMYT1Lの役割を詳しく調べるために、MYT1Lエクソン7（+/fl）のヘテロ接合性条件付きノックアウト対立遺伝子を用いてヒト胚性幹細胞（hESC）を操作しました（図4Aおよび補足図S6）。 MYT1L (+/fl) hESC は、NGN2 転写因子媒介分化を利用して、電気的に成熟したヒトニューロンに向けられました [29]。 これにより、条件付きで神経障害に関連する発生およびシナプスのプロセスを研究することが可能になります[55、56、57]。 Cre媒介MYT1L（+/-）欠失により、タンパク質が約50％減少し、患者で見られるMYT1Lハプロ不全症を模倣しました（図4B、補足図S6G）。 まず、初期および後期の成熟時点で、Δcre形質導入同系対照と比較したMYT1L枯渇の転写効果を評価しました（補足表S5）。 MYT1L 変異ニューロンは、ニューロンの GO 用語の減少と、調節解除された遺伝子の中でてんかん、統合失調症、および ASD に関与する遺伝子の濃縮を示しました [48、49] (図 4C および補足図 S7A)。 差次的に上方制御される遺伝子に関連するGO用語は、マウスモデルとヒトモデルの間で強く重複しており（補足図7B）（補足表S6）、保存された効果を示しています。 全体として、MYT1L の枯渇により、ニューロン誘導後の初期（1 週目）および後期（6 週目）でより強力な遺伝子活性化が生じました（図 4D および補足図 S7C）。 MYT1L DNA結合モチーフ（AAAGTT）は、MYT1L枯渇時に上方制御される遺伝子で濃縮されました（図4Eおよび補足図S7D、E）。 中胚葉特異的PRRX1やグリアスイッチ制御因子SOX9[58、59]など、非ニューロン細胞の運命を調節するいくつかの転写因子はMYT1Lモチーフを有しており、MYT1L欠損ニューロンで上方制御されていた（図4F）。 GSEAは、MYT1L枯渇時の筋細胞運命などの非神経遺伝子発現プログラムの上方制御を明らかにしました（補足図S7F）。 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）により、筋形成や心臓形成などの不適切な発達プログラムがMYT1L変異後に活性化されることが確認され、それらはMYT1Lによって継続的に抑制されていることを示唆しています（図4Gおよび補足図S7G）。 一方、プロモーターにMYT1Lモチーフを含まないVAX2やEN1などの神経転写因子は、1週間後に発現の減少を示したが、対照と比較して6週目に予想外の発現増加を示した（図4F）。 この発現パターンは、シナプス形成やカルシウムシグナル伝達などのニューロンの分化と機能に関与する経路に反映されており、MYT1L欠損ニューロンでは最初は抑制されていましたが、後に増加しました（図4Gおよび補足図S7G）。 重要なことに、ニューロン遺伝子の調節解除に関する我々の発見は、追加の独立して操作されたMYT1L（+/fl）hESCクローンに由来するニューロンにおいて再現されました（補足図S6およびS7）。 驚くべきことに、ニューロン遺伝子発現の遅延は、誘導された神経新生の10日または6週間後でもニューロンの複雑さに影響を与えませんでした（補足図S8）。 マウス線維芽細胞のニューロンの再プログラミング中に、MYT1L は Id3 などの抗神経新生遺伝子や WNT および NOTCH 経路メンバーを抑制することによってニューロンの運命を促進しました [21]。 ここで、ニューロン誘導中に MYT1L 欠損ヒトニューロンにおけるこれらの遺伝子の発現増加が観察されました (図 4F)。 WNT 経路と NOTCH 経路を標的とする化学阻害剤を組み合わせて適用すると、特に MYT1L 枯渇時に上方制御される遺伝子の発現を減少させることにより、TUJ1 タンパク質が制御レベルに回復し、RNA-Seq 測定に基づいて MYT1L 変異体の遺伝子発現変化が部分的に正規化されました（図 4H および補足図S9A、B）（補足表S7）。 さらに、通常、誘導された神経発生の早期にピークに達し、MYT1L変異ニューロンでは1週目に下方制御され、6週目に上方制御されるいくつかのニューロン前転写因子を同定しました（補足図S9C）。 これらの因子の発現は、MYT1L欠損ニューロンにおいて、1週目のWNTおよびNOTCH阻害によって正常化することができました（補足図S9D）。 全体として、これは、ヒト誘導神経新生中のMYT1Lのヘテロ接合欠失が自閉症関連遺伝子の制御解除と非ニューロン標的遺伝子の活性化を引き起こし、その結果、少なくとも部分的にWNTおよびNOTCHシグナル伝達の増加によって神経新生が遅延することを示している。

転写因子媒介誘導ヒト神経新生中の条件付きヘテロ接合性 MYT1L 欠失の概略図。 B 神経新生の誘導後 7 日 (1 週間) の細胞のウェスタンブロット定量をコントロールに対して正規化したもの。 示された抗体を使用した代表的なウェスタンブロット画像を示します。 n = 3。C コントロールに対して正規化した神経新生の誘導後 43 日 (6 週間) の MYT1L 変異ニューロンの調節解除された遺伝子は、フィッシャーの直接確率検定によって決定された、てんかん、統合失調症、および ASD に関連する遺伝子との有意な重複を示しました。 D 同系対照と比較した、1週間の成熟後のMYT1L枯渇ヒトニューロンにおける差次的に発現された遺伝子のボルケーノプロット。 強調表示されているのは、絶対 log2 倍変化 > 0.2 および p-adj < 0.1 で MYT1L 枯渇時にダウンレギュレート (青) またはアップレギュレーション (赤) された遺伝子です。 E MYT1L DNA 結合モチーフ AAAGTT は、パネル D の上方制御された遺伝子で有意に濃縮されました。 F MYT1L 枯渇時に選択された制御解除された遺伝子は、同質遺伝子対照と比較した倍率変化の下方 (青) または上方制御された (赤) として表示され、それぞれの MYT1L モチーフの数プロモーターが表示されます。 BE は、代表的なクローン 1 のデータを表示します。 G MYT1L 枯渇ヒト誘導ニューロンにおいて差次的に発現された遺伝子の Ingenuity Pathway Analysis (IPA)。 経路または生物学的機能の活性化 (赤) または阻害 (青) の状態は、Z スコア (右尾フィッシャーの直接確率検定) によって表されます。 結果は、転写因子媒介性ヒト神経新生の 1 週間後と 6 週間後の 2 つのクローンについて表示されます。 (+/fl) および (+/-) では、それぞれ n = 4 (クローン 1) または n = 5 (クローン 2)。 H 7日目のMYT1L枯渇誘導ヒトニューロンにおけるTUJ1タンパク質レベルの低下は、XAV939およびDAPTを介したWNTおよびNOTCH阻害によって回復することができます（n = 4（クローン1））。 棒グラフは平均値を示し、個々の生物学的複製からのデータポイントが表示されます。エラーバー = SEM、パネル B および H の対応のない t 検定、**p < 0.01、***p < 0.001。

MYT1L ハプロ不全がヒト細胞のニューロン機能に影響を与えるかどうかを調べるために、我々は、多重電極アレイ (MEA) を使用して、6 週間の成熟後の集団レベルで MYT1L (+/-) ニューロンの電気生理学的特性を研究しました [60、61]。 予想外なことに、ヒト MYT1L 変異ニューロンでは、対照と比較してスパイク発火が 2 倍になり、同時ネットワーク発火活性が 3 倍になったことが観察されました (図 5A)。 電気生理学的活性の変化はMYT1Lタンパク質の枯渇と直接相関し、ニューロン誘導後早ければ3週間後に発生し、15週目の長期実験の終了まで維持されました（補足図S10A〜C）。 電気生理学的表現型は、独立して操作されたMYT1L（+/fl）hESCクローンで再現できました（補足図S10D）。 次に、これらの機能変化がマウスの初代ニューロンで保存されているかどうかをテストしました。 そのために、MEAを使用して、Myt1l変異マウスおよび対照マウスに由来する培養海馬ニューロンの電気生理学的特性を調査しました。 ヒト MYT1L (+/-) ニューロンにおける我々の発見を要約すると、発火とネットワークの活動亢進の増加が観察されました。 これらの効果はMYT1L枯渇に比例し、対照と比較して平均スパイク発火増加が約700％（-/-）および約400％（+/-）でした（図5Bおよび補足図S11A）。 注目すべきことに、野生型ニューロンにおけるMYT1L99-1187の過剰発現はMEAに対する電気生理学的活性を変化させず、切断されたMYT1Lアイソフォームの潜在的なドミナントネガティブ効果を除外し、Myt1l変異マウスが機能喪失モデルであることをさらに裏付けました（補足図） .S11B）。 MEA 発火活性の増加は、出生時の MYT1L 欠損マウスの皮質に由来する一次ニューロンでも観察される可能性があり、欠陥が特定の脳領域に限定されず、ASD に関係する少なくとも 2 つの領域に影響を与えていることを示しています [62]（補足図 S11C） ）。 観察されたネットワークの活動亢進を単一細胞のシナプス活動と相関させるために、パッチ クランプ記録を実行しました。 観察されたネットワークの活動亢進と一致して、MYT1L欠損培養初代マウスニューロンでは、自発興奮性シナプス後電流（EPSC）および小型EPSC（mEPSC;テトロドトキシン（TTX）の存在下で記録）の振幅と周波数が増加しました（補足図）。 .S11D、E）それぞれ。 ヒトモデルと同様に、培養されたMYT1L欠損初代ニューロンのニューロン形態に有意な変化は観察されませんでした（補足図S11F）。 また、生後 1 か月のマウスの海馬 CA1 領域にある錐体ニューロンの電気生理学的脳スライス記録も実行しました。 我々のインビトロデータと一致して、対照と比較してMyt1l変異体における自発的EPSC頻度の増加が観察された（図5C）。 静止膜電位や誘発活動電位の特徴などの固有の特性は変化していないように見えました（補足図S12A）。 自発的抑制性シナプス後電流（CNQXおよびD-APVの存在下で記録されたsIPSC）の頻度は、MYT1L欠損錐体ニューロンで増加し、興奮の増加が抑制の減少に起因しないことを示しました（補足図S12B）。 私たちの実験は、MYT1L の継続的な枯渇がニューロンの機能を損ない、ヒトおよびマウスのニューロンにおいて予期せぬ電気生理学的活動亢進表現型を引き起こすことを示しています。

A 誘導神経新生の6週間後の、対照(+/fl、黒)と比較したMYT1L欠損(+/-;青緑)ニューロンにおける多電極アレイ(MEA)によって測定された自発性ニューロンネットワーク活動の増加。 代表的なラスター プロット、スパイクおよびネットワーク スパイクの定量化が示されています。 B in vitro 11日目（DIV11）の培養中の対照（+/+、黒）および変異体Myt1l（+/-、青緑および-/-、黄色）海馬ニューロンについてMEAによって測定されたネットワーク活動亢進。 代表的なラスター プロットと定量化が示されています。 C 急性マウス脳スライスにおける CA1 錐体ニューロンの自発興奮性シナプス後電流 (sEPSC) の増加。 代表的なトレース、定量化および累積分布が表示されます。棒グラフは、示された生物学的複製からのパッチされた細胞または MEA ウェルの数の平均値を表示します。エラーバー = SEM、パネル A および C ではマンホイットニー検定、パネルでは一元配置分散分析が行われます。 B、*p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001。

我々は、MYT1L変異による初代マウスおよび幹細胞由来のヒト誘導ニューロンにおけるMEA測定に基づいて、同様の電気生理学的ネットワークの活動亢進表現型を観察し、根底にある分子機構が保存されていることを示した。 MYT1L 変異による非神経標的遺伝子の活性化がヒトおよびマウスのモデルで観察されたため、これが表現型の重複に寄与している可能性があります。 そのような標的を特定するために、我々は以下の遺伝子を分析した。(i) CUT&RUNによって決定されたように、生体内でMYT1Lによって結合された(図1Fおよび補足図S2G)(補足表S3)。 （ii）RNA-Seqによって決定されたヘテロ接合性MYT1L欠失により、初代マウスまたはヒト誘導ニューロンで調節が解除されました（補足表S5および8）。 （iii）IPAに基づく非ニューロン用語の上方制御に寄与しました（図4および補足図S4および7）。 (iv) 公開されている発現データセット [63] に基づくと、他の組織と比較して脳では発現が低かった。 驚くべきことに、これらの非ニューロン標的の78％（38個中30個）が、マウスおよびヒトのニューロンにおけるMYT1L枯渇により上方制御された（図6Aおよび補足図S13A）。 最も上方制御される標的はTFAP2Bであり、これが突然変異すると、顔面、管、手の異常を特徴とするチャー症候群を引き起こす可能性がある[64]。 興味深いことに、MYT1L 変異を持つ一部の患者は軽度の顔異形を示します [19、65]。 さらに、上方制御された標的遺伝子の上位 10 個の中で、突然変異により QT 延長症候群を引き起こす可能性がある心臓電位依存性ナトリウムチャネル SCN5A がほぼ 2 倍増加していることを発見しました [66]。 SCN5A はヒトおよびマウスのニューロンでは低い基礎発現を示し、MYT1L 欠損ニューロンでの発現増加により電気生理学的特性が変化する可能性があります。 MYT1L は成熟ニューロンで発現されたままであり、有糸分裂終了ニューロンでも機能することを示唆しています (補足図 S1A)。 したがって、有糸分裂終了後の MYT1L 欠損ニューロンにおける Myt1l 過剰発現 (OE) が、Scn5a などの標的遺伝子の抑制を回復できるかどうかを調べました。 Myt11 OEは、GFP OE対照と比較して、ニューロンマーカーTuj1の発現を有意に増加させた（図6Bおよび補足図S13B、C）。 重要なことに、Myt11 OEは、MYT1L変異ニューロンにおいて上方制御されていた標的遺伝子、特にHes1およびScn5aの発現を減少させた(図6C)。 驚くべきことに、我々は、Myt11 OEもニューロンネットワーク活動を制御レベルに回復させることを発見した(図6D)。 これらの結果は、MYT1L 変異によって引き起こされる有糸分裂後ニューロンにおける遺伝子発現の継続的な調節解除が電気生理学的活動亢進表現型に寄与しており、これらは神経発達が完了した後でも回復する可能性があることを示唆しています。 SCN5Aの上方制御が電気生理学的活動亢進表現型を引き起こすかどうかをテストするために、マウス初代およびヒト誘導ニューロンの両方でshRNA媒介SCN5Aノックダウンを実行しました。これにより、SCN5Aレベルが80％減少し、MEAを使用してニューロンネットワーク活性を測定しました（補足図S13D）。 驚くべきことに、Scn5aノックダウンは、(+/-)および(-/-)マウス一次ニューロンにおけるニューロンネットワークの活動亢進を野生型レベルまで低下させた(図6E)。 これは、MYT1L（+/-）ヒト誘導ニューロンにおけるSCN5Aノックダウンによって再現でき（図6G）、SCN5Aの上方制御がマウスおよびヒトのMYT1L変異ニューロンにおける電気生理学的ネットワークの活動亢進に少なくとも部分的に寄与していることを示している。 潜在的な治療介入を見つけるために、ナトリウムチャネル遮断薬でありFDA承認の抗てんかん薬であるラモトリギン[67、68]がMYT1L欠損症によって誘発される表現型を救済できるかどうかをテストすることにしました。 実際、ラモトリギンの急性適用は、ヒトおよびマウスの両方のMYT1L欠損ニューロンの電気生理学的ネットワークの活動亢進を対照レベルに向けて正常化した(図6F、H)。 最後に、ニューロンネットワークの活動亢進がMyt1l変異時に観察される行動表現型に寄与しているかどうかを研究し、これらが生体内での薬理学的介入にも適しているかどうかをテストするために、マウスにラモトリジンを注射しました。 Myt1l変異マウスの急性ラモトリギン治療により、未治療の対照マウスに対して、オープンフィールドテストでの不安と多動行動、およびホームケージ観察での移動と立ち上がりが正常化されることがわかりました（図6Iおよび補足図S13E）。 全体として、これらの結果は、神経発達の欠陥に加えて、MYT1L 変異がマウスおよびヒトのニューロンにおける非ニューロン遺伝子の上方制御およびニューロンネットワークの活動亢進を引き起こすことを示しています。 有糸分裂後ニューロンおよび成体マウスにおける急性ラモトリギン治療により、電気生理学的ネットワークの活動亢進と試験された行動表現型の両方が回復し（図6J）、電気生理学的効果がマウスの行動の変化に少なくとも部分的に寄与していることを示しています。 したがって、MYT1L 変異は発達に影響を与えるだけでなく、成人期の神経機能や行動にも影響を与えることから、標的治療が発達の後期段階でも患者に利益をもたらす可能性があることが示唆されています。

MYT1L 欠損ヒトニューロン (6 週目) および in vitro 11 日目 (DIV11) の初代マウスニューロンにおける調節解除された非ニューロン MYT1L 標的遺伝子には、心臓ナトリウム チャネル SCN5A が含まれます。 RNA-Seq に基づく遺伝子発現の調節解除は、コントロールと比較した倍率変化として表示されます。(+/fl) および (+/-) の場合は n = 4 (ヒト)、(+/+) および (+/+) の場合は n = 3 (マウス) (+/-)、それぞれ。 GTEx ポータルからの組織発現データは Z スコアとして表示されます。 B マウス初代海馬および誘導ヒト神経細胞培養物における遺伝的および薬理学的レスキュー実験の概略タイムライン。 C qRT-PCRで測定したGFP OEと比較した、DIV3でのMyt11過剰発現(OE)時のDIV11でのMYT1L欠損マウス初代海馬培養物におけるMYT1L標的遺伝子Scn5aおよびHes1の有意なダウンレギュレーション。 グラフには、中央値が表示された縦棒散布図が表示されます。 n ≥ 8。 D MYT1L 欠損マウス初代ニューロンにおけるネットワークの活動亢進は、DIV3 の有糸分裂後ニューロンにおける Myt1l の過剰発現によって DIV11 で回復することができます。 E DIV3での有糸分裂後ニューロンにおけるshRNA発現によるScn5aのノックダウンは、Myt1l (+/-) および(-/-) ニューロンのスパイク頻度を減少させた。 F MYT1L を欠損したマウス初代ニューロンの活動亢進は、DIV11 に 10 μM ラモトリジンを急性適用することによっても回復できます。 ヒト誘導ニューロンにおけるshRNAによるG SCN5Aノックダウンは、スパイク頻度の減少をもたらした。 H MYT1L 変異時のスパイク発火の増加は、6 週目に誘導されたヒトニューロンに 10 μM ラモトリジンを急激に投与することにより、対照に向けて正規化されました。 I オープンフィールド試験では、Myt1l (+/-) 変異体は、対照動物と比較して中心領域でより長い距離をカバーすることが示されました。 P23 と 20 mg/kg のラモトリギンの急性適用により、これらの多動表現型を正常化できます。 ビヒクル: (+/+) の場合は n = 23、(+/-) の場合は n = 29、ラモトリジン: 3 つの独立したコホートからのデータ (+/+) の場合は n = 19、および (+/-) の場合は n = 23。 J 発達の初期および出生後段階における MYT1L の重要な役割と、両方の段階で遺伝的および薬理学的介入によって部分的に補うことができる MYT1L 喪失時の欠陥の概略図。 棒グラフは、示された生物学的複製または個々の動物からのデータポイントからの MEA ウェルの数による平均値を表示します。エラーバー = SEM、パネル C ではマンホイットニー検定、パネル D ～ I では二元配置分散分析、*p < 0.05、* *p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001、NS は有意ではありません。

ほとんどの精神神経疾患に関連するクロマチン制御因子とは異なり、転写因子 MYT1L は事実上すべてのニューロンで特異的に発現され、生涯を通じて発現し続けます [11、12]。 しかし、MYT1L 変異が神経精神疾患を引き起こすかどうか、またどのように引き起こすかについては、依然としてよくわかっていません。 この研究では、MYT1L ハプロ不全が、標的遺伝子を抑制できず、(i) 発達神経新生の遅延、および (ii) シナプスの遅延を引き起こすため、ヒトのニューロンおよびマウスモデルにおいて NDD および ASD に関連する表現型を引き起こすのに十分であるという証拠を提示します。成熟したニューロンの機能不全。 我々のヒトおよびマウスモデルにおけるMYT1L欠損は、MYT1L変異を有する患者で診断されているてんかん、統合失調症、およびASDに関連する遺伝子の大幅な調節不全を引き起こした[13、14、15、16]。 また、Myt1l 変異マウスの脳における遺伝子発現の変化が、ASD 患者の脳で観察されたものと直接似ていることも発見し、MYT1L 欠損が ASD 関連の転写プロファイルを引き起こす可能性があることを実証しました。 ASD および MYT1L 関連の NDD に関連するその他の表現型には、神経発達の遅延や脳の解剖学的構造の変化が含まれます。 われわれは、トランスクリプトーム解析を用いて、インビトロでの転写因子媒介ニューロン分化によるMYT1L欠損ヒトニューロンの成熟ダイナミクスの変化と、インビボでのMyt1l変異マウスの前頭前野における神経新生の障害を観察した。 E18.5でも、Myt1l変異マウスは胎児初期の遺伝子発現プログラムの活性化と胎児中期プログラムの下方制御を示し、これは他のASDモデルでも報告されている[5]。 以前の研究では、shRNA治療によるMyt1lまたは密接に関連するファミリーメンバーであるMyt1の急性枯渇は、Hes1発現およびNotchシグナル伝達を抑制することにより子宮内での神経新生を損なうことを示した[21、69]。 今回、我々は、生殖系列Myt1l変異が発生中の皮質前駆細胞の細胞周期終了を妨げ、出生時のSVZ内のSOX2+神経幹細胞の数を増加させることを示すことでこれらの発見を拡張し、これはHes1過剰発現表現型に似ている[46]。 実際、WNT と NOTCH の化学的阻害を組み合わせると、ヒト誘導ニューロンにおけるプロニューロン遺伝子の初期誘導を回復できる可能性があります。 これは、MYT1L欠損による神経新生の障害を裏付けており、Myt1l変異マウスで観察される皮質の薄化と、ヒトおよびマウスモデルでの神経発達の遅延を説明できる可能性がある。

私たちの研究の限界の 1 つは、aa 75 にナンセンス変異を持つ報告された患者と同様に、ヒトとマウスの MYT1L 両方の早期 STOP コドンをもたらすと予測されるフレームシフト変異のみをモデル化したことです [15]。 私たちのマウスモデルでは、エクソン 6 [70] にフレームシフトが発生し、核局在シグナルなどの必須ドメインを欠いた非機能的な MYT1L タンパク質アイソフォームが生成されましたが、ヒトモデルではエクソン 7 の条件付き欠失により、ナンセンス媒介 RNA 崩壊が生じました。 注目すべきことに、両方のモデルは同様の遺伝子調節解除および電気生理学的表現型を示し、機能喪失により突然変異の種類とは無関係に重複する欠陥が生じることが示唆されました。 特に、最近の 2 つの研究では、追加の Myt1l マウス モデルについて説明しています。 チェンら。 はエクソン 15 にフレームシフト変異を生成しました [26]。 エクソン 9 切除変異体を使用しました [27]。 3 つのモデルはすべて、ホモ接合型 Myt1l ノックアウトによって出生後の致死と脳形態の変化が生じるという共通点があり、発達における MYT1L の重要な役割が強調されています。 さらに、3 つの研究すべてで、多動を含む行動表現型が見つかりました。 私たちの研究と一致して、Kim et al。 不安の減少を報告しました。 チェンら。 は、男性特有の社会的行動の障害を報告しており、異なるアッセイと発達段階を使用しているにもかかわらず、私たちのモデルでもそれが見つかりました。 それにもかかわらず、3 つの Myt1l 変異マウス モデルは、異なる遺伝子発現と神経発達の欠陥を示します。 私たちの研究とは対照的に、Chen et al. らは、E14.5のMyt1l欠損マウスにおいてQ画分の増加とSOX2+神経幹細胞の減少を報告し、MYT1Lが主に転写活性化因子として作用することを示唆した。 しかし、最近のプレプリントで同じ著者らは、MYT1Lが初期のニューロン発達プログラムに関与する遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーに結合し、抑制することを発見した[71]。 今回我々は、単細胞トランスクリプトミクスを用いて、MYT1Lが喪失すると皮質ニューロンにおいてMYT1L結合遺伝子が実際に活性化され、リプレッサーとしての役割を裏付けることを示した。 これに沿って、Chen らもそして私たちの研究では、発達後期において初期の神経発達遺伝子サインの発現が増加していることがわかりました。 注目すべきことに、すべての研究は、規制解除された遺伝子とASD遺伝子セットとの有意な重複を報告している。 したがって、これら 3 つの Myt1l マウス モデル間の違いは、突然変異の異なる性質、マウスの遺伝的背景、および実験条件を反映している可能性がありますが、それらの重複により、神経発達における MYTL の重要な役割が強調されます。 機能喪失型バリアントに加えて、MYT1L を含むいくつかの新規ミスセンスバリアント、インデル、ゲノム重複および欠失が精神神経疾患患者で報告されている [19、65]。 MYT1L患者は巨頭症と小頭症の両方を含む多様な表現型を示し、ASDや統合失調症などのさまざまな精神神経疾患と診断されているため、追加のマウスおよびヒト幹細胞を操作することによって、特定の突然変異または遺伝的背景がこれらの表現型にどのように影響するかを明らかにするための将来の研究が必要となるだろう。モデル、または人工多能性幹細胞から患者由来のニューロンを生成することによって。

遺伝子発現の変化や神経新生の遅延として現れる神経細胞のアイデンティティーの不安定化に加えて、MYT1L 欠損ニューロンでは顕著な電気生理学的表現型が観察されました。 予想外なことに、初代マウスおよび誘導されたヒトニューロンは、sEPSC 振幅と mEPSC 周波数の増加に支えられて、ニューロンネットワーク活動の 3 ～ 4 倍の増加を示しました。 MYT1L欠損錐体ニューロンではsIPSCの頻度が増加しているため、我々のモデルではネットワーク活動の増加が阻害の減少によって引き起こされる可能性は低い。 しかし、新生Myt1l (-/-) マウスでは、単一細胞分析に基づいて、Cdca7+介在ニューロン集団の減少とともに、皮質層Iニューロンの割合のわずかな増加が観察されました。 したがって、抑制性ニューロンに対する MYT1L 変異の影響は依然として解明されておらず、今後の研究が必要です。 ネットワークの表現型は、ニューロンの形態やシナプス密度の変化、電位依存性ナトリウムチャネルやカルシウムチャネルの調節解除などの神経伝達物質放出を調節する一般的な機構など、複数の要因によって説明できる可能性がある[72、73、74]。 興味深いことに、SCN5Aなど、通常ニューロンでは特異的に発現しないチャネルの上方制御も、MYT1L変異ニューロンにおける正常なシナプス伝達を損なう可能性がある。 したがって、我々は、MYT1Lの過剰発現、shRNAを介したSCN5Aノックダウン、またはナトリウムチャネルとカルシウムチャネルをブロックすると報告されているラモトリジン治療[67、68]が、MYT1L変異によって誘発されるネットワークの活動亢進を救済できるかどうかをテストした。 驚くべきことに、MYT1Lの過剰発現は、有糸分裂終了後のMYT1L欠損マウスニューロンにおけるScn5aやHes1などの標的遺伝子の発現を減少させ、MYT1Lの過剰発現とSCN5Aのノックダウンは両方とも電気生理学的ネットワークの活動亢進表現型を回復させた。 さらに、ラモトリジンの急性適用は、有糸分裂後の MYT1L 欠損ヒトおよびマウスのニューロンのネットワーク活動亢進表現型だけでなく、マウスで観察されるいくつかの行動活動亢進表現型も正常化しました。 これは、特定の MYT1L ハプロ不全に関連する表現型が、開発の後半であっても遺伝的介入や低分子薬によって救済できる可能性があることを示唆しています。

全体として、我々は、MYT1L 変異が神経細胞の運命と機能を不安定化し、ヒトおよびマウスのモデルにおいて ASD 関連の表現型を引き起こすのに十分であるという最初の証拠を提示する。 したがって、ニューロンにおける非ニューロン遺伝子発現をサイレンシングできないことは、少なくとも部分的にASDの病因に寄与する可能性がある新規なメカニズムを表している。 MYT1L は、生涯を通じてほぼすべてのニューロンで特異的に発現される、神経発達疾患に関連する独自の転写因子です。 したがって、非神経プログラムの生涯にわたる活発な抑制は、脳障害の予防にとって重要な進化的に保存された経路であると推測したくなる。 興味深いことに、MYT1Lレベルはマウスとヒトの両方で加齢に伴い減少し（補足図S1A）、最近、神経細胞のアイデンティティの喪失がアルツハイマー病モデルにおいて役割を果たすことが示唆されており[75、76]、これは神経変性もまた加齢に伴う可能性があることを示唆している。ここで紹介する新しい MYT1L 媒介機構によって調節されます。 最後に、有糸分裂後のマウスおよびヒトのニューロンにおけるMYT1L欠損による予期せぬ電気生理学的ネットワークの活動亢進と、それに関連するマウスの行動表現型が、承認薬ラモトリジンによって鋭く標的にされる可能性があり、これが治療介入の機会を提供する可能性があることを示す。

すべてのデータは本文または補足資料で入手できます。 GSEA は上記のように実行されました。 次世代シーケンス データは、NCBI GEO GSE171327 で入手できます。 質量分析データは PRIDE PXD037867 でアクセスできます。

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MYT1L 欠損マウスの作成と寛大な共有に対する L. Meng 氏と M. Wernig 氏の支援に感謝します。 技術的なアドバイスをいただいた I. Everlien と、最初の転写分析をいただいた K. Oliveras Mate に感謝いたします。 DKFZの中核施設、特にゲノミクスおよびプロテオミクス中核施設(A. Schulz)、scOpenLab(P. Mallm)、前臨床研究センター(S. So)および光学顕微鏡施設(M. Brom, D.クルニッチ）。 また、ハイデルベルク大学学際神経行動コアの B. Kurpiers 氏と C. Pitzer 氏の多大な支援に感謝いたします。 アイデアとディスカッションを提供してくれた C. Schaaf、D. Odom、F. Winkler、L. Steinmetz、H. Ahlenius、A. Agarwal、および T. 金丸を含むモール研究室のメンバーに感謝します。

この研究は、Chica and Heinz Schaller Stiftung、2019 NARSAD Young Investigator Grant、DFG SFB1158-SO2、および CAc および CellNetworks への 2021 Fritz Thyssen Grant (EXC81)、2020 NARSAD Young Investigator Grant、DFG 504019642、ERC StG​​ からの資金提供によって支援されました。 No 804710 および Hector Stiftung II gGmbH から MM へ。 DP は DFG SFB1324 によってサポートされています。 DAAD/ANID から JC (57451854/62180003) に、ヘルムホルツ国際大学院から BW、JFT、BL、JT、MS にフェローシップが提供されました。 Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

イグナシオ・L・イバラ

現在の住所: 計算生物学研究所、ヘルムホルツ ツェントルム ミュンヘン、ドイツ環境衛生研究センター、85764、ノイヘルベルク、ドイツ

これらの著者は同様に貢献しました: Bettina Weigel、Jana F. Tegethoff。

細胞運命工学および疾患モデリング グループ、ドイツがん研究センター (DKFZ) および DKFZ-ZMBH Alliance、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ベッティーナ・ヴァイゲル、ヤナ・F・テゲソフ、サラ・D・グリーダー、ブライス・リム、ブヴァネスワリ・ナガラジャン、ジュール・トルバーグ、フアン・M・エイドリアン・セガラ、ローラ・K・シュミット、ジャニナ・カスパー、エリック・ポワゼル、エリサ・ハインゼルマン、マヌ・サラスワット、マーリーン・クリスト＆モーリッツモール

HITBR Hector Institute for Translational Brain Research gGmbH、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ベッティーナ・ヴァイゲル、ヤナ・F・テゲソフ、サラ・D・グリーダー、ブライス・リム、ブヴァネスワリ・ナガラジャン、ジュール・トルバーグ、フアン・M・エイドリアン・セガラ、ローラ・K・シュミット、ジャニナ・カスパー、エリック・ポワゼル、エリサ・ハインゼルマン、マヌ・サラスワット、マーリーン・クリスト＆モーリッツモール

中央精神衛生研究所、マンハイム医学部、ハイデルベルク大学、68159、マンハイム、ドイツ

ベッティーナ・ヴァイゲル、ヤナ・F・テゲソフ、サラ・D・グリーダー、ブライス・リム、ブヴァネスワリ・ナガラジャン、ジュール・トルバーグ、フアン・M・エイドリアン・セガラ、ローラ・K・シュミット、ジャニナ・カスパー、エリック・ポワゼル、エリサ・ハインゼルマン、マヌ・サラスワット、マーリーン・クリスト＆モーリッツモール

ハイデルベルク大学生物科学学部、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ベッティーナ・ヴァイゲル、ヤナ・F・テゲソフ、ブライス・リム、ジュール・トルバーグ、マヌ・サラスワト

ドイツ、ハイデルベルク大学病院ハイデルベルクおよびDKFZ臨床神経生物学科

ユウチャオ・リュー & ハンナ・モニエ

幹細胞とがんのプロテオミクス部門、ドイツがん研究センター (DKFZ)、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ディミトリス・パパジョルジオ & イェローン・クリッジスフェルト

ハイデルベルク大学医学部、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ディミトリス・パパジョルジオ & イェローン・クリッジスフェルト

ヨーロッパ分子生物学研究所、構造および計算生物学ユニット、69115、ハイデルベルク、ドイツ

クリスチャン・アーノルド、イグナチウス・L・イバラ、ジュディス・B・ザウグ

チカおよびハインツ・シャラー研究グループ、解剖学および細胞生物学研究所、ハイデルベルク大学、69120、ハイデルベルク、ドイツ

ホアキン・カンポス & クラウディオ・アクーニャ

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BW と JFT は、研究の設計、実施、分析、原稿の準備を担当しました。 BL、EP、MS、ILI、および CAr は、バイオインフォマティクス分析を設計および実装しました。 SG は幹細胞工学と誘導ニューロンの実験を実施しました。 JT、LKS、MC、JK は初代培養と画像解析に貢献しました。 BN と JK は行動研究を支援しました。 JAS は単一細胞実験を実施しました。 YCL、JC、CAc は電気生理学を実施しました。 DP と JK は質量分析を実行しました。 HM、CAc、JZ は研究計画と原稿の準備についてアドバイスしました。 MM は研究を設計および監督し、データを解釈し、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

モーリッツモール対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Weigel, B.、Tegethoff, JF、Grieder, SD 他。 ヒトのニューロンおよびマウスにおける MYT1L ハプロ不全は、自閉症に関連する表現型を引き起こしますが、遺伝的および薬理学的介入によって回復させることができます。 モル精神医学（2023）。 https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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受信日: 2022 年 3 月 24 日

改訂日: 2022 年 12 月 30 日

受理日: 2023 年 1 月 11 日

公開日: 2023 年 2 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-01959-7

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