歌学習における社会認証のための神経回路

Nature Communications volume 13、記事番号: 4442 (2022) この記事を引用

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コミュニケーションを学ぶには、社会的な交流が不可欠です。 人間の言葉や鳥のさえずりでは、幼児は正確な発声パターンを獲得し、それを模倣源ではなく生きた教師と関連付けることを学ばなければなりません。 しかし、音声学習中の社会的現実の神経メカニズムはまだ不明です。 ここでは、キンカチョウの正確な歌学習をサポートする社会認証のための神経回路を特徴付けます。 私たちは、生きている大人の家庭教師から歌を学習している間の、幼鳥の注意/覚醒状態制御中枢である青斑核（LC）の神経活動を記録しました。 LC 活動は、学習中に人工的ではなく実際の社会的情報によって増加し、学習した歌の精度と堅牢性が向上しました。 ライブでの社会的歌の学習中に、LC活動は聴覚記憶領域である尾内側ニドパリウム（NCM）における長期の歌選択的神経反応を調節した。 したがって、NCMにおけるLCシナプス前シグナル伝達の光遺伝学的阻害は、生の家庭教師の歌に対するNCMニューロンの反応性を低下させ、歌の学習を阻害した。 これらの結果は、LC-NCM 神経回路が、歌の音響特徴とは異なる実際の社会的相互作用の感覚的証拠を統合して、歌の学習を認証することを示しています。 この発見は、脳の発達における社会情報を検証するための一般的なメカニズムを示唆しています。

音声によるコミュニケーションを持つ脊椎動物では、音響訓練に生身の大人の家庭教師との本物の社会的相互作用が伴う場合、早期の聴覚学習がより効果的です。 人間の乳児における実際の社会的相互作用による音声曝露は、音素検出の発達を誘発します 1 が、受動的な聴覚曝露は言語発達を成功させるには不十分です 2。 同様に、鳴き鳥の幼鳥は、ライブ講師との音声コミュニケーションを通じて効果的に歌うことを学びますが、講師の歌の録音された再生に受動的にさらされると、歌の質が低下します3、4、5。 キンカチョウの幼鳥では、歌の再生をトリガーすると歌の学習が向上します6。これは、注意力やモチベーションなどの内部状態が学習を促進することを示唆しています。 最近の証拠は、歌の学習における神経調節の役割を示唆しています。 中脳水道周囲灰白質（PAG）は、ドーパミンシグナル伝達を介した文化伝達のための音声コピーを促進します5。 ノルアドレナリン作動性 (NE) シグナル伝達のもう 1 つの主要な神経調節指令センターである青斑核 (LC) は、注意と覚醒を調節し、内部状態情報を脳全体にブロードキャストすることが知られています。 LC ニューロン活動は、長期記憶、感覚知覚、モチベーションなどの行動プロセスを調節し、学習と記憶を促進します 7、8、9、10、11。 生きた歌の家庭教師に若鳥を曝露すると、スピーカーを通して同じ歌を受動的に曝露した対照の幼鳥と比較して、LC ニューロンにおける初期遺伝子の発現が増加します4。 LC ニューロンは、解剖学的に鳥の高次聴覚野である尾内側ニドパリウム (NCM) 12、家庭教師の歌の記憶形成のための脳の位置として提案されている 13,14 に投影します。 私たちは最近、NCM ニューロンのサブセットが家庭教師の歌に選択的に反応し、家庭教師の存在下でそれらのニューロンの聴覚反応が増加することを報告しました 13,15。 しかし、NCM の神経活動が、家庭教師の歌の音響的特徴とは別に、家庭教師からの社会情報を LC を介して統合できるかどうかは不明のままです。 この研究では、社会的に相互作用する家庭教師から歌を学ぶキンカチョウの幼鳥のLC-NCM神経回路におけるニューロン活動を記録し、操作しました。 私たちは、生きている成人の家庭教師との音声コミュニケーション中に、LC-NCM神経回路の神経活動の亢進を観察しました。 生の歌の家庭教師にさらされている間にLC-NCM神経回路が光遺伝学的に抑制された青少年は、家庭教師の歌を学習しなかった。このことは、この神経調節機構が正確な歌を学習するための韻律パターンの処理と同時に社会情報を統合し、認証していることを示唆している。

社会的に交流する生きた雄成鳥から家庭教師を受けたキンカチョウの幼鳥は、家庭教師の歌に受動的にさらされたものと比較して、より正確かつ堅牢な歌学習を発達させ、哺乳類の注意レベルを制御すると報告されているLC4の即時初期遺伝子発現を示します8,9。 、10． 今回我々は、自由に動き回るキンカチョウの幼鳥が単独でいるとき、または家庭教師と社会的に交流しているときに、LCまたはNCMの単一ニューロン活動を記録し、LC-NCM神経回路が歌の学習を可能にするために家庭教師との社会的交流の情報をエンコードしているかどうかを確認した。 個別指導期間中に、LC または NCM のいずれかから 352 個のニューロンを記録しました (補足表 1)。 記録されたニューロンの数は、げっ歯類を用いた以前の研究 7、9、16、17 や、麻酔をかけた鳥を用いた研究 12、18、19 よりも比較的少なかった。 しかし、自由に移動する幼鳥の電気生理学的神経記録は、体の大きさや立ち姿勢のせいで制限されます。 したがって、我々のデータは、自由に移動する鳴き鳥の単一単位の活動を記録した研究に匹敵するものでした5,13。 鳥には、4 つの異なる歌刺激（TUT）、同種のキンカチョウ成鳥の 2 つの歌（CON1 および CON2）、およびベンガルフィンチ鳥の異種異種の 1 つの歌（HET）の 4 つの異なる歌刺激それぞれについて約 20 分間の受動的な歌の再生を与えました。 ）。 再生セッション (再生 1) に続いて、30 分間のインターバルを挟んで 60 ～ 120 分間、生で歌う講師 (LIVE TUT) にさらされ、その後、さらに 20 分間のパッシブ再生 (再生 2) と 30 分間のインターバルが続きました。再び長い間隔になります（図1a）。 げっ歯類における最近の証拠では、その波形と活性化モードに基づいて、1 つのノルアドレナリン作動性細胞タイプと 2 つの GABA 作動性細胞タイプからなる不均一な LC ニューロン集団が報告されています 16。したがって、我々は、12 匹の幼体から記録された 29 個の LC ニューロンを、発火率に基づいて規則的スパイクまたはレギュラースパイクのいずれかに分類しました。発火速度に基づいた高速スパイク（補足図1a〜c）。 高速スパイクニューロンは、同様のスパイク期間と形状を示しました（補足図1a左、補足図1b）。 対照的に、規則的なスパイクニューロンは、スパイクの形状と期間の両方でより大きな変動を示し（補足図1a右、補足図1b）、これは、げっ歯類で以前に示唆されたように、規則的スパイクニューロンが不均一なニューロンサブタイプで構成されていることを示唆しています16。 歌の学習に対する家庭教師との社会的相互作用の影響を明確に確認するために、前日の家庭教師の効果を損なうことなく、生の家庭教師の歌への曝露の効果を比較できるように、家庭教師の初日に記録された神経活動に焦点を当てました。 29 個のニューロンのうち 13 個は、数時間続いた繰り返しの歌のプレゼンテーションまたは家庭教師の歌の曝露中に失われ、そのため、家庭教師の初日に記録された残りの 16 個のニューロン (7 個の高速スパイクと 9 個の定期的なスパイク) は失われていました。歌の反応性についてさらに分析しました。 興味深いことに、すべての高速スパイク LC ニューロンは、ケージ内への家庭教師の導入に応じて一瞬 (1.62 ± 0.25 秒、n = 7) 発火を一時停止しましたが、規則的なスパイク ニューロンは発火を停止しませんでした (補足図1d）。 通常のスパイクと高速スパイクの両方のLCニューロンは、受動的な曲の再生に応答して発火を増加させました（補足図1e）。 発火の増加は曲の再生中ずっと持続し、LC ニューロン活動のパターンは同じ曲を繰り返し提示するたびに変化しました。このことは、ニューロンの反応が特定の曲の特徴や音節と関連していないことを示しています。 社会的相互作用を伴うLIVE TUT歌唱に対するLCニューロンの反応は、受動的TUT再生の場合と比較して大きかった（図1b、c）。 注目すべきことに、家庭教師の歌に長期間（約60分）曝露した後、LCニューロンは、LIVE TUTの歌に曝露する前の反応と比較して、すべての歌刺激の再生に対する反応が増加しました（図1b〜e）。 個別指導の2日目以降に記録された一部のLCニューロンは、TUT再生よりもLIVE TUTに対してわずかではあるが有意に大きな反応を示しましたが、LIVE TUTを聞いた後はより高い反応を維持しなかったことがわかりました（補足図1f）。 しかし、TUTと他の歌への反応を比較したd'値が-0.5から0.5の間であったため、個別指導の初日に家庭教師の歌にさらされた後でも、LCニューロンのどれもTUTに対する選択的聴覚反応を発達させないことがわかりました（図1f） ）、特定の曲に対する応答強度（RST）は、LIVE TUT 曝露（プレイバック 1 および 2）の前後の両方で、他の曲に対する応答強度（RST）と有意な差はありませんでした（二元配置分散分析とそれに続くホルム・シダック事後検定、p > 0.05) (図 1d)。

a 実験計画とタイムラインの概略図 (dph = 日数、孵化後)。 講師の曲の再生（プレイバック 1 および 2）、講師の歌（LIVE TUT）（b）、または LIVE TUT を聞く前（プレイバック 1）と後（プレイバック 2）の異なる曲の再生（d）に対する LC ニューロンの平均応​​答強度 (RST) ）。 LIVE TUT の前後 (c、スケール バー: 1 秒)、または LIVE TUT を聞く前 (再生 1) と後 (再生 2) の別の曲の再生に対する単一の LC ニューロンのスパイク活動のラスター プロット (e、スケールバー: 2 秒) (曲のスペクトログラムを下部に示します)。 挿入図: 同じ LC のスパイク波形 (c、平均 ± SD、スケール バー: 水平方向 0.5 ms、垂直方向 0.5 mV)。 f LIVE TUTを聞く前（プレイバック1）と後（プレイバック2）のLCニューロンの他の歌刺激に対するTUTの平均dプライム値。 ボックスは 25 ～ 75% を示し、中心線は中央値によって定義され、白四角は平均値によって定義されます。 ひげには 1.5 IQR (四分位範囲) 内のすべてのデータ ポイントが含まれており、「アウトサイダー」ドットはひげの線の外側にあるデータ ポイントです。 灰色の領域は非選択的応答を示します (-0.5 < d' 値 < 0.5)。 N = 8、n = 16 (b、d、f)。 TUT: 家庭教師の歌、CON1: 同種の歌 1、CON2: 同種の歌、HET: 異種の歌、N: 鳥の数、n: ニューロンの数。 平均±標準誤差、*p = 0.046、***p < 0.001 または p = 0.0000251 (HET)、両側スチューデント T 検定 (HET、d)、または両側マンホイットニー順位和検定 (b、d) 。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 a の鳥の絵は Nicolas Baudoin によって作成されました。

LC活動とは対照的に、NCMのニューロンのサブセットは、LIVE TUTへの曝露後、特にTUT再生に対してRSTを増加させましたが、他の曲に対しては増加させませんでした（補足図2a、b）。 家庭教師の初日に 5 人の少年から 80 個の NCM ニューロンが記録され、そのうち 57 個はスパイクの形状と発火速度からブロードスパイク (BS) ニューロンでした 13。 ほとんどのBSニューロンは、TUTの歌の再生よりもLIVE TUTの歌唱に対してより大きな反応を示したことがわかりました（図2a、再生l対LIVE TUT）が、LIVE TUTの歌を聞いた後、TUT再生に対するRSTは同様のレベルに戻りました。 (図 2a、再生 1 対 2、補足図 2d)。 しかし、BS NCMニューロンのサブセット（n = 12）は、歌に合わせた発火パターンを維持しながら、LIVE TUTの歌唱に対してより大きな反応を示し（図2b、d、再生l対LIVE TUT）、TUTに対する反応の増加を維持したことがわかりました。 LIVE TUT にさらした後でも再生できます (図 2b、d、再生 2)。 これらのニューロンは、LIVE TUTを聞いた後、TUTの曲に選択的に反応し、他の曲の再生に対してRSTを増加させませんでした（図2c、および補足図2a、b）。 TUT に対する RST は、LIVE TUT (プレイバック 2) を聞いた後の他の曲の再生に対する RST よりも大幅に高かったが、LIVE TUT (プレイバック 1) の前ではそうではありませんでした (二元配置分散分析とそれに続くホルム-シダック事後検定) 、p < 0.05）（補足図2b）。 TUT の再生に対して選択的反応を示すが、他の曲に対しては示さないニューロン (TUT 選択的ニューロン) の割合は、LIVE TUT を聞いた後、大幅に増加しました (3 個から 12 個のニューロンへ) (図 2e、f)。 さらに、TUT 歌に対する RST の増加および/または TUT 選択的ニューロンの割合が個別指導の後半に発生したかどうかを調べました。 私たちは、個別指導の 2 日目に TUT 再生に対する RST を増加させ、TUT 選択的応答を示し始めた少数のニューロン (n = 4) を発見しました。 しかし、個別指導の3日目以降、LIVE TUTを聞いた後、RSTまたはTUT再生に対する選択性を増加させるニューロンは見つかりませんでした（図2f、g）。 個別指導の 3 日目または 4 日目には、約 2 時間の指導の間、まったく歌を歌わなかった講師もいます。 どちらの場合も、家庭教師との社会的相互作用中にLIVE TUTが歌うかどうかにかかわらず、RSTからTUTへの歌の再生やTUT選択ニューロンの割合の増加は見られませんでした（図2f、g）。 個別指導初日の TUT 選択 BS ニューロンの RST から TUT への再生は、LIVE TUT 後 (プレイバック 2) では他の曲の再生よりも大幅に高かったが、その前 (プレイバック 1) ではそうではなかったことがわかりました。 対照的に、TUT に対する RST は、家庭教師が歌ったかどうかに関係なく、家庭教師の 2 日目以降の LIVE TUT の前後の両方で、他の曲の再生に対する RST よりも有意に高かった (二元配置分散分析とそれに続くホルム・シダック事後検定、 p < 0.05) (図 2g)。 個別指導の3日目と4日目にLIVE TUTの歌を聞く前に、すでにTUTに対して選択的反応を示していたBSニューロンの一部を発見しました（図2f）。 これらのニューロンは、LIVE TUTの歌唱に対してより大きな反応を示さず、LIVE TUTにさらされた後もTUT再生に対するRSTを増加させませんでした（図2gおよび補足図2c）。 さらに、個別指導の初日に、ナロースパイキング（NS）NCMニューロンが、TUTの歌の再生よりもLIVE TUTの歌に対してより大きく反応しましたが、有意に高くはありませんでした（p = 0.1）（補足図2e）。 一部のNSニューロンは、LIVE TUTの歌を聞いた後、TUT再生に対するRSTの増加を示しましたが、他の歌の刺激に対するRSTも増加したため、TUTに対する選択的反応を発現したニューロンはありませんでした（補足図2f、g）。

講師の曲の再生 (プレイバック 1 および 2)、講師の歌唱 (LIVE TUT) (a、b)、または別の曲の再生に対する、すべての BS NCM ニューロン (a) または TUT 選択的 BS ニューロン (b、g) の平均応答強度 (RST) 4 日間の個別指導 (g) を通じて、LIVE TUT を聞く前 (再生 1) と後 (再生 2) の曲 (+)、または無言の講師にさらされる (-) 曲。 c LIVE TUTを聞く前（プレイバック1）と後（プレイバック2）のTUT選択的BSニューロンの他の歌刺激に対するTUTの平均dプライム値。 ボックスは 25 ～ 75% を示し、中心線は中央値によって定義され、白四角は平均値によって定義されます。 ひげには 1.5 IQR (四分位範囲) 内のすべてのデータ ポイントが含まれており、「アウトサイダー」ドットはひげの線の外側にあるデータ ポイントです。 灰色の領域は非選択的応答を示します (-0.5 < d' 値 < 0.5)。 d 講師の曲の再生 1 および 2 または LIVE TUT に対する TUT 選択的 BS NCM ニューロンのスパイク活動のラスター プロット (曲のスペクトログラムを下部に示します) (スケール バー: 1 秒)。 挿入図: 同じ TUT 選択的 BS ニューロンのスパイク波形 (平均 ± SD、スケール バー: 水平方向 0.5 ms、垂直方向 0.5 mV)。 LIVE TUT を聞く前 (プレイバック 1) と後 (プレイバック 2) で、1 つの曲に対して選択性を示す (e、f)、または選択性を示さない (e、非選択) BS NCM ニューロンの割合。 N = 5、n = 57 (a)、n = 12 (b、c)、n = 80 (e、f: 1 日目以降)、n = 77 (f: 2 日目以降)、n = 44 (f: 3 日目以降) )、n = 31 (f: 3日目−)、n = 44 (f: 4日目+)、n = 30 (f: 4日目−)、n = 12 (g: 1日目+)、n = 12 (g: ２日目＋）、ｎ＝７（ｇ：３日目＋）、ｎ＝４（ｇ：３日目−）、ｎ＝５（ｇ：４日目＋）、ｎ＝３（ｇ：４日目−）。 BS: ブロードスパイク ニューロン、TUT: チューター ソング、CON1: 同種の歌 1、CON2: 同種の歌、HET: 異種の歌、N: 鳥の数、n: ニューロンの数。 平均±標準誤差、*p = 0.0242、***p = 0.0000143、0.0000518、両側スチューデント T 検定 (a、b、g)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

青少年のLCおよびNCMニューロンは、社会的相互作用を伴うLIVE TUTに対してより大きな聴覚反応を示し、BS NCMニューロンの一部は、LIVE TUTへの曝露後にTUTの歌に対する選択的反応を発達させた。 LC ニューロンは、成人では解剖学的に NCM に投影していることが報告されています 12,17。 我々は、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV2/9-hSyn-Cre、AAV2/9-FLEX-GFP）をLCに注射することにより、幼体におけるLC-NCM投影を確認した。 NCMでGFP陽性軸索が見つかりました。これは主にDBHまたはTH抗体と免疫反応性でしたが、GABAに対する免疫反応性はありませんでした（補足図3a）。 次に、NCMのLC末端を光遺伝学的に不活性化することにより、LCニューロンの活動がNCMのニューロンの聴覚応答性を調節する程度を調査しました（図3a）。 NCM ニューロンは家庭教師の最初の 2 日間で TUT 選択的反応を発現し、一部の家庭教師は 3 日以上経っても幼鳥にさえ歌わないことが判明したため、私たちは幼鳥を家庭教師に 3 日間光遺伝学的刺激を与えました。 ウイルス混合物（AAV-2/9-hSyn-CreおよびAAV-2/9-FLEX-Arch-GFP）を注入して、LC内でアーキロドプシンを発現させました（図3b）。 次に、オプトプローブ（NeuroNexus、Buszaki16OCM16LP）を使用して、NCMニューロンのニューロン活動を記録し、同時に、幼体が聴覚を持っている期間中にのみ、ほとんどがDBHまたはTH陽性であったNCMのLC軸索を光遺伝学的に阻害しました（図3b）。 LIVE TUT ですが、単に家庭教師と対話しているときはそうではありません (図 3a)。 BS NCM ニューロンのほとんどは、個別指導の初日に社会的相互作用のあるライブ TUT の歌を聞くまでは、TUT の歌の再生に反応しませんでした (図 3c、再生 1)。 NCM の LC 入力が光遺伝学的に阻害された場合、LIVE TUT の歌唱に対する反応は増加しませんでした (図 3c、Optol + LIVE TUT)。また、LIVE TUT にさらされた後も TUT 再生への RST は増加しませんでした (図 3c、図 3c、再生 2)。 BS NCM ニューロンの小さなサブセット (n = 7) は、個別指導の初日に LIVE TUT の歌を披露する前に TUT の再生に対して選択的聴覚反応性を示しましたが、光遺伝学的阻害によって LIVE TUT への反応や TUT への選択性は増加しませんでした。は LIVE TUT 中に適用されました (図 3d–f)。 NCM における LC 軸索の光遺伝学的阻害は、これらのニューロンの自発発火率を変化させませんでした (2.63 ± 0.86 対 2.31 ± 1.09、再生 1 対 LIVE TUT+ 光阻害)。 さらに、TUT選択的BSニューロンの割合は、LC軸索の光遺伝学的阻害と組み合わせたLIVE TUT歌唱に曝露された後でも増加しませんでした（図3g）。対照の若年グループ（LCでGFPを発現し、受信した幼若）とは対照的に、 LIVE TUT中にNCMで同じレーザーを適用）、LIVE TUTを聞いた後、講師選択ニューロンの割合とRSTからTUTへの再生の両方が増加しました（補足図3b、c）。 BSニューロンの別のサブセット（n = 19）が見つかりました。これは、個別指導の初日にLIVE TUTの歌唱にさらされる前に、TUTだけでなく別の曲の再生にも反応しました（図4a、b、再生1）。 LIVE TUT中に光遺伝学的抑制が適用されると、LIVE TUTに対する反応が大幅に低下し（図4a、b、Opto+LIVE TUT）、両方の30分間でTUTに対する反応性が失われましたが、他の曲の再生には反応しませんでした（図4a、図4a、b、Opto + LIVE TUT）。 bおよびd、再生2）およびLCを不活性化したLIVE TUT歌唱に曝露した90分後（図4c、d、再生3）。 LIVE TUT 歌唱前、30 分後、60 分後の TUT への RST は、他の歌の再生の場合と有意な差はありませんでした（二元配置分散分析とその後のホルム・シダック事後検定、p > 0.05）（図 4d）。 これらの結果は、生きて歌っている家庭教師による NCM への LC 入力の活性化により、NCM 神経回路が特定のニューロンで TUT 選択的聴覚反応を獲得できることを示唆しています。

a 実験計画とタイムラインの概略図。 b 左上：Arch-GFPを発現するLCニューロンがドーパミンベータヒドロキシラーゼ（DBH）陽性（マゼンタ）であることを示すLCの傍矢状断面。 Arch-GFP を発現する LC 軸索末端が DBH 陽性 (マゼンタ、右上) またはチロシンヒドロキシラーゼ (TH) 陽性 (赤) であるが、GABA 陽性ではない (青、左下) ことを示す NCM の傍矢状断面 (スケール バー 100 μm: 左上) 、20um右上、および左下）。 右下: DBH、TH、または GABA に対して二重陽性である Arch-GFP 軸索末端の割合。 講師の歌の再生（プレイバック 1 および 2）または LC 入力の光遺伝学的不活性化による講師の歌（Opto+LIVE TUT）に対する、すべての BS NCM（c）または TUT 選択的 BS ニューロン（d）の平均応答強度（RST）。 e LC入力の光遺伝学的不活性化を伴う家庭教師の歌を聞く前（プレイバック1）と後（プレイバック2）の、TUT選択的BSニューロンの他の歌刺激に対するTUTの平均dプライム値。 ボックスは 25 ～ 75% を示し、中心線は中央値によって定義され、白四角は平均値によって定義されます。 ひげには 1.5 IQR (四分位範囲) 内のすべてのデータ ポイントが含まれており、「アウトサイダー」ドットはひげの線の外側にあるデータ ポイントです。 灰色の領域は非選択的応答を示します (-0.5 < d' 値 < 0.5)。 f 講師の曲の再生 1 および 2 または Opto+LIVE TUT に対する TUT 選択的 BS NCM ニューロンのスパイク活動のラスター プロット (スケール バー: 1 秒)。 挿入図: 同じ TUT 選択的 BS ニューロンのスパイク波形 (平均 ± SD、スケール バー: 水平方向 0.5 ms、垂直方向 0.5 mV)。 g Opto+LIVE TUT の前 (再生 1) と後 (再生 2) で、1 つの曲に対して選択性を示すか、選択性がない (非選択) を示す BS NCM ニューロンの割合。 N = 6 (b–e、g)、n = 83 (c)、n = 7 (d、e)、n = 110 (g)。 BS: ブロードスパイクニューロン、TUT: チューターソング、CON1: 同種ソング 1、CON2: 同種ソング、HET 異種ソング、N: 鳥の数、n: ニューロンの数。 平均±sem b–d 両側スチューデントT検定（c）、両側マンホイットニー順位和検定（d）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 a の鳥の絵は Nicolas Baudoin によって作成されました。

a、c 家庭教師の歌の再生 1 および 2、または LC 入力の光遺伝学的不活性化による家庭教師の歌唱に対する非選択的 BS NCM ニューロンのスパイク活動のラスター プロット (Opto+LIVE TUT) (a、スケール バー: 1 秒)、またはOpto+LIVE TUT の前 (再生 1) と後 (再生 3) の異なる曲の再生 (c、スケール バー: 2 秒、下部に曲のスペクトログラムを表示)。 挿入図: 同じ非選択的 BS ニューロンのスパイク波形 (a、平均 ± SD、スケール バー: 水平方向 0.5 ms、垂直方向 0.5 mV)。 b 左、d 講師の曲の再生 (プレイバック 1 および 2)、Opto+LIVE TUT (b)、または前後 (プレイバック 3) の異なる曲の再生に対する非選択的 BS NCM ニューロンの平均応​​答強度 (RST) ) Opto+LIVE TUT (d)。 b右、Opto+LIVE TUTの前（プレイバック1）と後（プレイバック2）の非選択的BSニューロンの他の歌刺激に対するTUTの平均dプライム値。 ボックスは 25 ～ 75% を示し、中心線は中央値によって定義され、白四角は平均値によって定義されます。 ひげには 1.5 IQR (四分位範囲) 内のすべてのデータ ポイントが含まれており、「アウトサイダー」ドットはひげの線の外側にあるデータ ポイントです。 灰色の領域は非選択的応答を示します (-0.5 < d' 値 < 0.5)。 N = 6、n = 19 (b、d)。 e NCMにおけるLCの光遺伝学的阻害（光阻害、左）または制御レーザー刺激（コントロール、右）を伴うLIVE TUTを聞いた後、講師の曲の再生に対するRSTの増加または減少を示すNCMニューロンの割合。 N = 6 および 6 (それぞれ光阻害および対照)、n = 110 および 138 (それぞれ光阻害および対照)。 BS: ブロードスパイク ニューロン、TUT: チューター ソング、CON1: 同種の歌 1、CON2: 同種の歌、HET: 異種の歌、N: 鳥の数、n: ニューロンの数。 平均±標準誤差、*p = 0.023、***p < 0.001、両側マン・ホイットニー順位和検定 (b、d)。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

3 日間の個別指導期間中、LIVE TUT への曝露と LC 軸索不活化が組み合わされた場合、NCM ニューロンの大部分 (76.4%、110 個中 84 個のニューロン) は、幼若動物の RST から TUT への再生に有意な変化を示さなかった。 さらに17.3％（n = 19）のNCMニューロン、主にBSニューロン（68.4％、n = 13）は、RSTからTUTへの再生を減少させました（図4e、光阻害、左）。 対照的に、LCでGFPを発現し、レーザー照射と組み合わせて家庭教師の歌にさらされた対照幼体では、NCMニューロンの約半数(51.5%、71/138ニューロン)がRSTからTUT再生まで増加し、半数(45.1%)がRSTからTUTへの再生を増加させた。 、n = 32）、そのうちBSニューロンでした（図4e、コントロール、右）。 数は少ないですが、そうでなければサイレントなNSニューロンのサブセット（n = 9）は、LC末端が光遺伝学的に阻害された場合にのみ活性化されました（歌の開始ではなくレーザーに位置合わせされました、補足図4a、b）。 これらの結果は、LC-NCM神経回路における歌選択的聴覚反応性を獲得するために、LCからの機能入力を介してNCMの神経回路活動を調節するには、家庭教師との音声コミュニケーションが不可欠であることを示唆している。

我々の発見は、少年が家庭教師の生の歌を聴いている間にLC-NCM入力が不活性化された場合、NCMニューロンはTUTに対する選択的聴覚反応を発達させることができないことを示している。 次に、NCM への LC 入力が、青少年が家庭教師と社会的に対話することによって歌を学ぶために必要かどうかを調べました。 光遺伝学的抑制（または対照群ではレーザー照射）による電気生理学的記録を受けた若鳥は、成鳥になるまで隔離して飼育されました。 次に、彼らの大人の歌を録音し、家庭教師の歌との類似性を測定しました (図 5a)20。 生の社会的相互作用を伴う家庭教師の歌の間にNCMへのLC入力が不活性化された鳥の歌は、対照鳥の歌と比較して、家庭教師の歌との類似性が著しく低かった（図5b、c）。 成鳥のキンカチョウの歌と、幼若期に曝露された他の歌刺激との間の歌の類似性をさらに比較すると、対照鳥とLC不活性化鳥の両方でどちらの歌にもほとんど類似性が示されず、歌の再生刺激からの学習が不十分であることが示されました（図5c） ）。 総合すると、これらの結果は、歌の再生への受動的曝露は実質的な学習につながらない一方、生きた鳴く鳥への社会的曝露は、学習中にLC-NCM神経回路が活性化している場合にのみ効果があることを示唆している。 家庭教師の歌との類似性の低下が、LCの不活化により声の運動パターンを変える能力を失うことによって引き起こされたのかどうかを調査するために、我々は、少年の歌と最終的な大人の形式との歌の類似性を追跡した。 コントロールの若鳥は、最終的な成鳥の歌との類似性を徐々に高め、成鳥の形態に合わせて歌を柔軟に学習したことを示しています（図5d）。 さらに、対照鳥はより変化しにくい音節を発達させましたが、逆に、LC-NCM回路の不活性化中に家庭教師の歌を聞いた鳥は、隔離された鳥と同様に、成体でも騒々しい音節を歌い続けました（より高いエントロピー値とピッチの良さ、図5e）。孵化直後21． ただし、LC 不活化は、生来の音声パターン、テッツ、スタック、およびカックルの鳴き声の音響構造を変化させませんでした。これらの鳴き声のエントロピー値とピッチの良さは、対照とLC不活化された幼体の間で発育を通じて差がなかったためです（補足図5a、補足図5a、 b)、LCの不活性化が運動障害を引き起こさないことを示唆しています。 まとめると、これらの結果は、NCM への LC 入力が、少年が家庭教師との音声コミュニケーションから適切な歌の質を学ぶために必要であることを示しており、これが本物の社会的相互作用を介した効果的な歌学習の基礎となるメカニズムとして提案されています。

開発に関する実験的なタイムライン。 b 家庭教師の歌（上）、2 羽の兄弟の鳥の大人の歌の歌スペクトログラム。 兄弟 1 (光抑制): 家庭教師の歌を聞くと、LC 入力が光遺伝学的に抑制されました。 兄弟 2 (対照): 家庭教師の歌を聞いたときに NCM ニューロンがレーザー刺激されました (スケール バー: 0.2 秒)。 c LC入力が光遺伝学的に阻害された鳥（光阻害）、または家庭教師の歌唱中にNCMニューロンがレーザー刺激を受けた鳥（対照）の各歌刺激に対する成体の歌類似性スコアの平均。 ボックスは 25 ～ 75% を示し、中心線は中央値によって定義され、白四角は平均値によって定義されます。 ひげには、1.5 IQR (四分位範囲) 内のすべてのデータ ポイントが含まれます。 d LC入力が光遺伝学的に阻害された鳥（光阻害）、または家庭教師の歌唱中にNCMニューロンがレーザー刺激を受けた鳥（対照）で家庭教師の歌を聞いた後の、歌の発達中の各時点での鳥自身の結晶化した大人の歌との歌類似性スコア。 e LC光阻害のある鳥（左）と対照鳥（右）の歌の発達全体を通しての音節の平均エントロピーと平均ピッチの良さの散布図。各ドットは単一の音節を示します。 N = 6および6（それぞれ光阻害および対照、c〜e）。 TUT: 家庭教師の歌、CON1: 同種の歌 1、CON2: 同種の歌、HET: 異種の歌、N: 羽数、dph: 孵化後の日、「***」は同じグループ内での差異を示し、「#」は差異を示します2 つの動物グループ間、平均±標準誤差、#p = 0.00000533、***p = 0.0000000514、0.0000000277、0.00000108、両側スチューデント T 検定。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

今回我々は、人工ではなく生きた家庭教師の歌声に曝露されたキンカチョウの幼鳥におけるLC-NCM神経回路活動の変調を実証する。 家庭教師の歌唱中に NCM への LC 投影が不活性化されると、NCM の歌選択的神経反応性の発達が妨げられ、少年の歌学習が妨げられました。 我々は、このメカニズムを「社会的認証」と呼んで、社会的に相互作用する生きた、例えば「本物の」大人の家庭教師に対する神経符号化要件を説明する。 機能的には、認証回路は聴覚皮質のような高解像度の音響音声情報を処理するのではなく、対照的に、LC神経活動の分析が示すように、学習中の生きた社会的状況を監視または「認証」するものであると提案します。

ノルアドレナリン作動性 LC は、社会的コミュニケーションの学習に関与する神経回路のシナプス活動を調節することが知られています。 哺乳類では、LCは、状況に応じた注意（闘争または逃走など）や覚醒に基づく脳状態の神経調節と関連付けられており、LCニューロンは、マウス、ラット、サル、ヒト、キンカチョウの皮質全体にNEシグナルを伝達し、調節する。さまざまな感覚刺激の認識7、8、9、10、11、16、17、22。 生の講師による指導は、聴覚、視覚、触覚、嗅覚を含む多感覚体験です。 我々の現在のデータは、LC が皮質ブロードキャストのための多感覚社会情報を NCM にどのように統合し認証するかという興味深い問題を提起しています。 私たちは、LCとNCMが聴覚視床領域である卵形核から共通の解剖学的入力を受け取ることを発見しました（補足図6）。これは、少年が家庭教師との社会的コミュニケーションを維持するときに、NCM回路がLCを介してフィードフォワード入力、おそらく神経調節入力を受け取ることを示唆しています。 家庭教師の歌に対する LC ニューロンの反応は歌の音響的特徴に依存しなかったのに対し、対照的に NCM の上流にある L 野などの聴覚野のニューロンは歌の音響的特徴に反応するため 23、NCM が候補領域であることを示唆します。これは、歌を記憶するためにライブ講師の歌唱の社会的情報と音響的情報の両方を統合することができます。

NCM の点火に対する NE 変調の長期的な影響に関する我々の観察は注目に値します。 生の家庭教師の歌唱中のLC光遺伝学的不活性化は、他の社会的相互作用では変化しなかったが、認証された家庭教師の歌に対して選択的なNCMの聴覚反応性を数時間変化させた。 シナプス後皮質ニューロン 24 または LTP 25,26 の短期可塑性における NE シグナル伝達のシナプス機構はよく知られており、海馬における LC 由来の NE/DA シグナル伝達は、LTP を介して記憶の固定を強化することが示唆されています。 今回我々は、LIVE TUTを聞いている間のLC活性の直接阻害が家庭教師からの歌の学習を妨げることを示し、さらにLCが長期記憶形成に寄与していることを示唆した。 キンカチョウの NCM ニューロンは、NE または α-アドレナリン受容体拮抗薬のいずれかを注入すると、主に自発発火率を低下させ、歌に対する聴覚反応の精度を高めることによって、発火パターンと聴覚反応性を変化させます 12、28。 我々は、家庭教師との社会的コミュニケーションが、おそらく徹底的なLC入力による家庭教師からの社会学習の最初の2日間における長期持続皮質（NCM）の聴覚反応性を調節するが、すでに選択的聴覚反応性を獲得しているニューロンには影響を及ぼさないことを示す。 対照的に、LC ニューロンは TUT 選択的反応性を獲得せず、個別指導 2 日目以降でも LIVE TUT に対してより大きな反応を示しました。 これらは、社会的な家庭教師の歌の経験が、発育中常にLCニューロンからのNE放出を引き起こす一方で、LCから放出されたNEが長期的な可塑性を引き起こし、シナプス後（NCM）ニューロンの特定のサブセットに家庭教師の歌の記憶を形成させ、次のような症状を発現させる可能性があることを示唆している。発達中の聴覚学習段階における特定のNE受容体。 我々の現在の研究では、LC が NCM にプロジェクトするニューロンのタイプまたはパターンは明らかにされていません。 LC-NCM と NE 放出の間の解剖学的関係、NCM のさまざまなニューロンタイプにおける受容体発現、NCM のシナプス可塑性に関するさらなる研究は、NE の神経調節がどのようにして選択的聴覚反応性を獲得するかという、根底にある神経回路機構の解明に役立つであろう。特定のニューロン。

私たちの発見は、人工的ではない生の歌の指導中に、別のモノアミン神経調節物質であるドーパミン（DA）による中脳PAGから感覚運動野HVCへのシグナル伝達が歌のコピーを促進することを実証した最近のキンカチョウの研究を補完し拡張するものである5。 どちらの研究も、発声学習にはライブ講師が必要であることを示しているが、時間スケールと上行性聴覚感覚運動経路の解剖学的段階が異なる。PAG-HVC回路を介したDAは発声における役割と一致するHVCの急性知覚を媒介するのに対し、NEはHVCの急性知覚を媒介する。 LC-NCM 回路は、歌の聴覚記憶のために長期にわたる知覚を調整します。 2つの研究を総合すると、正確な歌の記憶と文化の伝達のために歌の音響的特徴を洗練するための社会学習の質を継続的に監視するために、DAとNEのシグナリングが並行して機能する、社会認証のための皮質下システムの進化が示唆されている。

最近の文献では、霊長類における社会的コミュニケーションのための分散型皮質ネットワークについて説明しています 29,30。 鳴き鳥に関する我々の結果は、音声学習における社会情報を認証するための特定の神経回路を探索することにより、この新たなフレームワークに注釈を付けています。 進化の観点から見ると、複雑で騒がしい自然環境でコミュニケーションをとる鳴鳥などの動物は、生存と繁殖のための正確な歌の伝達を確保するために、種固有の個別の指導者との社会的相互作用を検証するための神経機構を発達させてきた可能性があります。 例えば、「歌の共有」仮説は、メスの鳥は明確に定義された系統または地理的領域を持つ単純で正確な歌を好むことを示唆しており、歌唱中の家庭教師の認証が適応メカニズムである可能性があります。 今後の研究では、LC-NCM 回路における NE 依存の社会認証が個々の家庭教師とその独特の歌の長期記憶エンコードを容易にするかどうか、また同様のメカニズムが人間の音声獲得に適用できるかどうかについて検討する必要がある。

実験は、沖縄科学技術大学（OIST）大学院大学の動物管理委員会によって承認された実験プロトコールに従って実施されました。 私たちのコロニー（14L：10Dの明暗条件）で孵化し、飼育された34羽のオスのキンカチョウをこれらの実験に使用しました。 すべての鳥は、父親が除去される孵化後 10 ～ 12 日後 (dph) まで、親および兄弟と一緒にケージで飼育されました。 その後、幼体は、NCM または LC への電極埋め込み手術を受ける 54 ～ 56 日、またはウイルスベクターが注射される 33 ～ 35 日まで、消音室に置かれたケージ内で母親や兄弟とともに育てられました。 LCに入る。 ウイルスベクターを注射された幼体は、NCMへの光電極埋め込み手術を受ける54〜56dphまで母親と兄弟と一緒に育てられた。 電極または光電極を埋め込まれた幼体は、成体になるまで（120dph以降）屠殺されるまで、音響減衰室に個別に収容された。 手術から回復した後（約 24 ～ 48 時間後）、3 ～ 4 日間連続して歌の再生刺激にさらされている間の単一ユニットのニューロン活動が記録され、その後 3 日間、家庭教師がケージに導入され、幼体が記録されました。生徒は、生の家庭教師の歌唱（LIVE TUT）にさらされ、その後、同じ歌の刺激が再生されました。 NCMに光電極を埋め込まれた幼体は、家庭教師が歌っているときにレーザーパルス刺激を受けました。

pENN-AAV-hSyn-Cre-hGH (addgene ウイルス調製物 #105555-AAV9、James M. Wilson からの贈り物) と AAV-FLEX-Arch-GFP (addgene ウイルス調製物 #22222-AAV9、James M. Wilson からの贈り物) のウイルス混合物Edward Boyden) または AAV-pCAG-FLEX-EGFP-WPRE (addgene ウイルスプレップ #51502-AAV9、Hongkui Zeng からの贈り物; 比率 1:3) を単離された液体で LC (100 ～ 180 nL) に一方的に注入しました。定位固定調整 (LC: ヘッド角度: 27°、AP: -0.3 mm、 ML: 0.9 mm、深さ: 5.8 ～ 6 mm、Y 副鼻腔の中心に対して）イソフルラン麻酔下（2.5 ～ 2.7%）。 約 3 週間後 (54 ～ 56 dph)、AAV を注射した幼体を実験に供しました。

単一ユニットのニューロン活動が、自由に行動する 12 羽の雄のキンカチョウの幼鳥の LC から記録されました。 マイクロドライブに接続された単一のタングステン電極 (WE3PT32.0A3、MicroProbes) を、定位固定調整 (ヘッド角度: 27°、AP: -0.3 mm、ML: 0.9 mm、DV: 5.7 ～ 5.9 mm、中心に対して相対的に) で埋め込みました。 Y 副鼻腔）を使用し、イソフルラン麻酔（2.5 ～ 2.7%）下で歯科用セメント（スーパーボンド C&B キット、サンメディカル、日本）で頭蓋骨に固定しました。 キンカチョウの幼体の別のサブセット (n = 5) に、定位固定調整 (頭部角度: 内部 45°、AP: 0.2 mm、ML: 0.5 mm) で NCM に 16 チャンネルのシリコン プローブ (Buzsaki16-CM16LP、NeuroNexus) を移植しました。 、DV: 1.5 ～ 1.9 mm、Y 副鼻腔の中心に対して）上記と同じ方法で。 手術から回復した後（約 24 ～ 48 時間）、幼体は記録アリーナに配置され、ヘッドステージ（LC の場合は HST/8o25-GEN2-10P-G1-xR または HST/16o25-GEN2-18P-2GP-）に接続されました。 NCM の場合は G1、(Plexon))、ニューロン活動記録用 (56 ～ 60 dph)。 歌の再生プレゼンテーション中、ニューロンの記録は、1 日あたり約 1 時間、各歌の 10 回の繰り返しで 3 × 20 分、4 日間連続で実行されました。 生の家庭教師の歌唱中、神経記録は 1 日あたり 3 ～ 4 時間、各曲の再生を 20 分間 10 回繰り返し、その後 30 分間の休憩をとり、その後 1 ～ 2 時間、講師がアリーナにいて時折歌いながら記録されました（10 ～ 20 分間）、その後さらに 30 分間の休憩と 20 分間の曲の再生プレゼンテーションを 4 日間連続で行います。 曲の再生刺激は、カスタム MATLAB コード (MATLAB 2018b、MathWorks) を使用して編集され、カスタム LabVIEW コード (LabVIEW 2016 64 ビット バージョン、National Instruments) とデータ収集デバイス (NI USB-6341、 National Instruments) は、再生刺激情報を分割し、それを OmniPlex システム (Plexon) のアナログ入力チャンネルとスピーカー アンプ (Topping TP21 T-Amp Class T Mini Amplifier) の両方に供給するために使用されます。

神経信号は、OmniPlex システム (OmniPlex Software、PlexControl、Plexon) を使用して 10,000 ～ 20,000 倍に増幅され、0.5 ～ 9 kHz でバンドパス フィルター処理されてデジタル化されました (40 kHz)。 歌の刺激はアリーナの上部にあるスピーカーから再生され、すべての音声活動は神経記録とともにマイク (ラベリア マイク、C417 PP、AKG) を介して記録されました。

電気生理学的記録とそれに続く歌の記録の完了後、電気的損傷を与え（10mAで10秒間）、記録部位を組織学的に確認した。

光遺伝学と組み合わせた NCM 記録のために、16 チャンネルのシリコン プローブ (Buzsaki16-CM16LP、NeuroNexus) を NCM に埋め込みました。 神経活動の記録中（56〜60 dph）、光ファイバーをパッチコード（FCMH2-FCL、2×2 MMカプラー50:50 200um 0.39NA FC/PC-LCフェルール、Thorlabs）に取り付けました。 ニューロンの記録は、1日あたり5〜6時間、各曲の再生を20分間10回繰り返し、その後30分間の休憩をとり、その後1〜2時間の家庭教師の立ち会いとレーザーパルス（10〜15 mW、589 nm）を組み合わせて時折歌を歌って行われました。ファイバー結合の黄色 DPSS レーザー、Shanghai Laser & Optics Century Co.)、続いてさらに 30 分間の休憩、20 分間の曲再生プレゼンテーション、90 分間の休憩、20 分間の曲再生プレゼンテーションを 3 日間連続で行いました。 講師のライブ歌唱中に NCM の LC 軸索終末のニューロン活動を光遺伝学的に阻害するため、講師が最初の前奏音符 (試合の開始) で歌い始めたときに、マスター 8 (エイト チャンネル) を使用して 3 秒のレーザー パルスを手動で適用しました。プログラマブル パルス スティミュレーター、MicroProbes) を DPSS レーザーと OmniPlex システムのデジタル入力に接続しました。 3 秒のレーザー パルスが終了したときに講師が歌い続けた場合は、別の 3 秒のパルスが適用されます。 レーザーパルス照射のタイミングを電気生理学的データとともに記録した。 鳥の行動と発声は、ケージ内に設置され、それぞれ Ulead Video Studio と Avisoft-RECORDER (Avisoft Bioacoustics) ソフトウェアに接続されたカメラとマイクを使用して継続的に記録および監視されました。

実験用幼体の歌は、Avisoft-RECORDER (Avisoft Bioacoustics) を使用し、オーディオ インターフェイス (Fast Track Ultra 8R、M-AUDIO) に接続されたマイク (ラベリア マイク、C417 PP、AKG) を介して音響減衰室で録音されました。パソコン。 TUT、CON1、CON2、および HET の歌も、Avisoft-SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics) ソフトウェアを使用して、電気生理学的実験で歌刺激として使用するために録音および編集されました。 家庭教師後の発声学習の程度を評価するために、実験用の少年の歌を時速80、100、120dph（2～3日間）で録音し、彼らの歌と家庭教師の歌の類似性（類似性%）をサウンドを使用して測定しました。 Analysis Pro 201120。 各鳥について、各時点の歌の 10 の歌のモチーフを、家庭教師の歌のモチーフとの類似性について測定し、電気生理学的記録中の歌の再生について平均しました。 歌のモチーフは、まず振幅の変化と周波数に基づいて別々の音節に分割されました。 ピッチ、ピッチ平均周波数、ピーク周波数、および良さなど、いくつかの音響特徴が定量化されました。 ウィーナーエントロピーと音節および音節間の間隔の長さ。 講師の歌との類似性は、ピッチ、音程の良さ、FM、AM、およびウィーナー エントロピーに基づいて 2 つの歌のモチーフ間の音響的類似性を定量化する Sound Analysis Pro 2011 の自動手順に従って、講師と生徒の歌のモチーフの間で測定されました。 平均値の非対称比較、最小継続時間 (10 ミリ秒)、10 × 10 比較などの Sound Analysis Pro 2011 のデフォルト設定を使用して、曲の類似性が計算され、類似性のパーセンテージがさらなる統計分析に使用されました。 80、100、および 120 dph での各分割された歌の音節またはそれぞれの異なる鳴き声 (テット、スタック、または高笑い) の安定性を評価するために、Sound Analysis Pro 2011 を使用して音節を測定するか、平均エントロピーと平均ピッチの良さを測定しました。

コレラ毒素サブユニット B (CTB) Alexa Fluor 488 または 555 コンジュゲート (Thermo Fisher Scientific) を、3 匹の隔離された雄キンカチョウの幼鳥 (52イソフルラン麻酔下（2.5〜2.7％）で定位固定を行い、圧力インジェクター（Nanoject II、Drummond Scientific Company、ブルーモール、ペンシルバニア州、米国）に接続されたピペットを介して-55 dph）を行います。 3 ～ 5 日後、鳥に麻酔をかけ、組織学プロトコールを実施しました。

実験後、鳥はソムノペンチルで深く麻酔され、生理食塩水で灌流され、次に 4% パラホルムアルデヒドで灌流されました。 ミクロトーム（RETORATOME REM-710、ヤマト）を使用して傍矢状脳切片（厚さ50μm）を作製した。 免疫染色では、スライスをマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体 (1:1500、#22941、Immunostar)、ウサギ抗ドーパミンベータヒドロキシラーゼ抗体 (1:1500、#22806、Immunostar)、またはウサギの一次抗体とインキュベートしました。抗 GABA 抗体 (1:500、#A2052、Sigma-Aldrich) を PBS-T (PBS 中に 0.3% Triton-X を含む) 中で 4 °C で 48 時間培養しました。 PBSで洗浄した後、スライスをAlexa 568と結合したヤギ抗マウス抗体（1:400、A11031、Thermo Fisher）またはAlexa 568と結合したヤギ抗ウサギIgG抗体（1:400、A11036）の二次抗体とインキュベートしました。 、Thermo Fisher)、4 °C で 48 時間。 スライスをマウントし（Fluoromount、Diagnostic BioSystem）、次に共焦点顕微鏡（LSM 780、Zeiss）による画像化に供した。

Arch-GFP/GFP 陽性軸索終末は、最初の 6 ～ 8 つの内側切片で定量されました。奇数の切片はすべてウサギ抗ドーパミン ベータ ヒドロキシラーゼ (DBH) 抗体で免疫標識され、偶数の切片はすべて DBH 抗体で免疫標識されました。マウス抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（TH）とウサギ抗GABA抗体の組み合わせ。 NCM 領域内の 4 つの視野の倍率 40 倍の顕微鏡写真を各切片から取得し、フィジーを使用して、Arch-GFP/GFP 陽性軸索末端内の DBH、TH、または GABA 二重標識軸索末端の割合を定量化するために使用しました ( ImageJ) ソフトウェア パッケージ。 これらの数は、セクション内および比較グループ内の鳥全体で平均され、光抑制グループの 6 羽と対照グループの 6 羽でした。

スパイク ソートは Offline Sorter v3 (Plexon) を使用してオフラインで実行され、十分に分離された単一ユニットは NeuroExplorer v5 ソフトウェア パッケージとカスタム MATLAB コード (MATLAB 2018b、MathWorks) を使用したその後の分析に提出されました。 LC ニューロンは、波形の形状と発火速度に基づいて規則的なスパイク ニューロンと高速スパイク ニューロンに分類されました。 各ユニットについて、平均スパイクの谷部分の半値全幅と、ピークから谷までの時間で定義されるスパイク継続時間を計算しました21。 感覚刺激が与えられなかった 50 分間のスパイクの数を平均することにより、自発発火率を計算しました。 自発発火率が 20 Hz 未満の LC ニューロンは規則的なスパイクとして分類され、20 Hz を超えるニューロンは高速スパイクとしてカウントされました。 NCM ニューロンは、平均スパイク幅と負のピークから正のピークまでの期間に基づいて、広いスパイク ニューロンと狭いスパイク ニューロンに分類されました 16。 NCM ニューロンと LC ニューロンの両方について、応答強度 (RST) によって各ニューロンの聴覚応答を定量化しました。これは、歌の刺激中の平均発火率 (FRstim) と、刺激直前の歌の刺激による同じ継続期間中の発火率の差です。 (FRbase) を次の式で計算します。

2 つの歌の刺激間の応答バイアスを測定するために、次の方程式を使用して d-プライム値を計算しました。

ここで、\(\overline{{{{{{\rm{RST}}}}}}}\) は刺激に対する平均反応強度、σ2 は RST25 の分散です。 D-プライム値 > 0.5 を、偏った応答の基準として使用しました。 TUT ソングと他のすべてのソングの間の d-プライム値の比較が 0.5 より大きい場合、ニューロンは TUT ソングに対して選択的であると分類されました。

すべての統計分析は、SigmaPlot 13.0 ソフトウェア パッケージを使用して実行されました。 比較したすべてのグループの正規性検定と等分散検定を伝えた後、スチューデントの T 検定またはマン・ホイットニー順位和検定を実施しました。 さらに、プレイバック 1、2、3 と、TUT、CON1、CON2、HET グループなどのさまざまな聴覚刺激で構成されるデータについては、「プレイバック」を使用して、二元配置分散分析とそれに続くホルム・シダック事後検定が実行されました。すべてのペアワイズ比較による最初の要素と 2 番目の要素としての「聴覚刺激」。 p < 0.05 の場合、すべての比較は有意に異なるとみなされました。 データ視覚化には、Origin 2019b ソフトウェアを使用しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。 この研究の結果を裏付けるデータは、補足表 1 に含まれています。この研究中に生成されたデータセット、およびこの論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

現在の研究中にデータ収集と分析に使用されたカスタム コードは、https://doi.org/10.5281/zenodo.6630127、https://doi.org/10.5281/zenodo.6630093、および https:/ に寄託され、入手できます。 /doi.org/10.5281/zenodo.6630340。

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原稿の作成にあたり貴重なご協力をいただきました横山 C. 博士、および博士の皆様に感謝いたします。 R. Mooney と SC Woolley、原稿の批判的な読解に感謝します。 MatLab のコーディングを支援していただいた M. Araki 博士と、実験動物の世話をしていただいた A. Kuneji さんに感謝します。 また、フィギュア用に鳥の画像を提供してくださった Nicolas Baudoin 氏にも感謝いたします。 この研究は、OIST 大学院大学と JSPS 科研費 JP 助成金 (#19K16302 が JK に、#18H02531 と #20H05075 が YY-S に) によって支援されました。

臨界期神経機構ユニット、沖縄科学技術大学院大学（OIST）、沖縄県

Jelena Katic, Yuichi Morohashi & Yoko Yazaki-Sugiyama

WPI-IRCN、東京大学、東京、日本

Yoko Yazaki-Sugiyama

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YY-S.、JK、YM が実験を計画しました。 JK は実験を実行し、データを分析しました。 YY-S。 そしてJKは論文を書きました。

Correspondence to Yoko Yazaki-Sugiyama.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Aditya Singh、Todd Troyer、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Katic, J.、諸橋 Y.、矢崎杉山 Y. 歌学習における社会認証のための神経回路。 Nat Commun 13、4442 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32207-1

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受信日: 2021 年 9 月 26 日

受理日: 2022 年 7 月 20 日

公開日: 2022 年 8 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32207-1

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科学レポート (2023)

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