連合核への前頭前投射は、連合学習中の刺激の行動的関連性をシグナル伝達する

Scientific Reports volume 12、記事番号: 11995 (2022) この記事を引用

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12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

再会核（RE）は、内側前頭前野（mPFC）と海馬（HPC）の間の相互作用に依存する記憶に必要です。 一例は微小瞬目条件付けであり、mPFC は嫌悪性無条件刺激 (US) との偶発性に応じて中性条件刺激 (CS) に対して異なる活性を示します。 この関連性信号が RE にルーティングされるかどうかをテストするために、RE 内の mPFC 軸索終末を測光的に記録し、学習によってその変化を追跡しました。 比較として、HPCとの接続を欠いている視床内側（MD）の前頭前部終末活動を測定しました。 ナイーブな雄ラットでは、RE 内の前頭前終末は音や光によって強く活性化されませんでした。 ラットが刺激の 1 つ (CS+) を US と関連付けると、端末は CS+ に対する反応を徐々に増加させましたが、他の刺激 (CS-) には反応しませんでした。 対照的に、MD 内の前頭前終末の刺激誘発反応は、条件付けの前であっても強力でした。 また、最初のコンディショニング セッションでのみ CS+ まで強化されました。 しかし、活動の分化の程度は学習によって改善されませんでした。 これらの発見は、連合学習がREへのmPFC出力を選択的に増加させ、感覚刺激の行動的関連性を示唆していることを示唆しています。

環境の手がかりと顕著な結果との間の関連性を形成する能力は、生物が適応して生き残るために依存する重要な認知プロセスです。 この連想学習プロセスは、古典的な条件付けパラダイムを使用して頻繁に研究されます。 特に、まばたき条件付け（TEBC）では、中立感覚刺激（条件刺激[CS]として知られる）と、まばたきの後に提示される軽度の嫌悪性まぶたショック（無条件刺激[US]として知られる）を関連付ける被験者の能力をテストします。短い時間間隔 (トレース間隔と呼ばれます)。 したがって、この時間的遅延が含まれることにより、小脳と脳幹の運動回路に加えて、海馬 (HPC)1、2、3 および内側前頭前皮質 (mPFC)4、5、6、7 を含む前脳領域の完全性が必要になります8。 、９． さらに、これらのCS-US刺激連合の形成は、背側HPC10、11およびmPFC12、13、14、15における連合の選択的発火パターンの発達を伴う。 さらに、学習により、mPFC はより強力な刺激誘発シータおよびガンマ帯域振動活動を発達させました 16、17、18。 さらに、mPFC シータバンド活動は、HPC シータバンド活動と時間的に連動するようになります 19。 まとめると、これらの発見は、mPFC と HPC の間の密接な相互作用が TEBC における刺激関連の形成に不可欠であることを示唆しています。

mPFC-HPC 相互作用をサポートする可能性のある解剖学的経路がいくつかあります。 単シナプス投射は腹側 HPC から mPFC に始まりますが、mPFC には HPC に戻る単シナプス興奮性投射がありません 20,21。 代わりに、mPFC は、中間構造を含むいくつかの多重シナプス経路を介して HPC 神経活動に影響を与える可能性があります。 視床正中核（RE）は、mPFC および HPC との相互の解剖学的接続を有するため、これらの中間領域の 1 つであると考えられています 22、23、24。 これまでの研究では、RE が mPFC-HPC の同調性 28,29,30 と、受動的回避 31、空間ナビゲーション 32,33、空間作業記憶タスク 28,34、文脈的恐怖条件付け 35 などの mPFC-HPC 相互作用を必要とするタスクのパフォーマンスをサポートするのに役立つことが示されています。 36、37、38、およびシーケンスメモリタスク39。 特に、TEBC における刺激連合の形成は、マウスの条件付けの最初の 2 日間に RE の高周波電気刺激によって損なわれました 40。

前述の証拠は、さまざまな形の認知プロセスの根底にある mPFC-HPC 相互作用を促進するための RE の必要性を裏付けていますが、mPFC-RE-HPC 経路内でどのような種類の情報が伝達されるか、より具体的には、どの程度の情報が伝達されるかについては不明のままです。どの mPFC 出力が刺激の関係的および物理的特徴に関連しているか。 この点に対処するために、ラットがTEBCを受けている間に、RE内で終わるmPFCニューロンの軸索におけるカルシウム動態の測光記録を実施した。 TEBC を使用すると、刺激のタイミングと偶発性を正確に制御できるため、感覚刺激と関係刺激の特徴に選択的な活動パターン、およびタスクのパフォーマンスとの相関関係を区別することができます。 比較として、内側視床背側 (MD) 内で終わる mPFC 軸索の活動における学習関連の変化を調査しました。 MD は、mPFC41、42、43 から強力な単シナプス投射を受け取りますが、HPC44、45 には投射しないため、その投射特異性に基づいた理想的な制御です。 私たちは、REとMDへの前頭前野出力が刺激関連に対して選択的であることを発見しました。 ただし、学習によって選択性が強化されるのは前者だけです。

到着時生後 77 日の合計 40 匹の雄ロングエヴァンス ラット (Charles River Laboratories) を、ホーム コロニー ルームの透明なプラスチック製ケージに個別に収容し、12 時間の明暗サイクルを逆転させました (10 時から暗)。 00 ～ 22:00）、食べ物と水は無料でご利用いただけます。 到着後 3 週間の体重は 375 ～ 410 g でした。 雄ラットのみを使用する理論的根拠は、(1) 卵巣ホルモンによるまばたき条件付け学習能力の性差 46、(2) TEBC における mPFC の機能と活性を調べる以前の研究は雄ラットのみを使用して実施された 7、12、16、 17. 行動実験は暗サイクル中に実行されました。 実験 1 (RE の薬理学的不活化) では合計 22 匹のラットが使用され、実験 2 (測光) では 18 匹のラットが使用されました。 実験 1 では、カニューレの標的を誤ったために 5 匹のラットが取り除かれ、行動データ分析のために 17 匹のラットが残されました。 実験 2 では、光ファイバーのターゲットが間違っていたために 4 匹のラットが除去され、行動条件付け中に内部ファイバーコアの破損により 1 匹のラットが除去されました。これにより、合計 13 匹のラットが行動および測光データ分析のために残されました。 すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイド (出版番号 85 ～ 23、1985 年改訂)、カナダ動物管理評議会、APA 倫理基準、ARRIVE ガイドラインに従って実行され、次の機関によって承認されました。トロント大学動物管理委員会 (AUP20011400)。

実験 1 で使用されたラットは、注入カニューレとアイワイヤーの埋め込みを含む 1 つの外科手術を受けました。 実験 2 で使用されたラットは 2 つの外科手術を受けました。最初はウイルスベクター注入手術、次に光ファイバーとアイワイヤー移植手術でした。

施設に到着してから 3 週間後、実験 2 のラットは麻酔をかけられ (酸素中 2.0 ～ 2.5 体積%のイソフルラン、流量 0.8 L/min、Halocarbon Laboratories)、定位固定フレームに配置されました。 頭蓋骨上の皮膚および組織を引っ込め、mPFC 上の両半球に 1 つの穴を開けました。 ポリエチレンチューブを介してマイクロシリンジ (Hamilton) に接続された 30G ステンレス鋼注入針を使用して、AAV9.CAG.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene) を次の座標に送達しました: 前後 (AP) = + 2.7、内側外側 (ML) = ± 0.55、背腹側 (DV) = ブレグマから − 3.9 mm。 ウイルスベクター(0.75μl/半球)を0.1μl/分の速度で注入した。 注射完了後、針を 5 分間その位置に放置し、その後、針を DV = - 3.7 mm まで後退させ、さらに 5 分間そのままにして、ベクターの拡散を確実に成功させました。 次いで、針をゆっくりと後退させ、切開部を縫合した。 ラットを手術後 48 時間、鎮痛剤 (カルプロフェン、5 mg/kg、皮下投与) で治療しました。 ウイルスの培養と発現を可能にするために、手術後ラットをホームケージ内で２か月間飼育した。

実験 1 では、施設に到着してから 5 週間後にラットをイソフルランで麻酔し、定位固定フレームに入れました。 頭蓋骨上の皮膚と組織を引っ込め、右半球の RE の上に穴を開けました (AP = − 2.1、ML = ブレグマから + 2.0 mm)。 ガイドカニューレ (Plastics One) を RE をターゲットとした穴を通して下げ、ダミースタイレットでキャップを取り付けました (AP = − 2.1、ML = + 2.0、DV = − 6.5 mm、ブレグマから正中線上 15 度の角度)。 カニューレは、ステンレスネジと歯科用アクリルを使用して頭蓋骨に固定されました。 薬剤を送達するために使用される注入カニューレは、ガイド カニューレの先端を 1 mm 超えて伸びていました。 コネクタ キャップ (Plastics One) に取り付けられた 4 本のテフロン コーティングされたステンレス鋼ワイヤが左上眼輪筋 (まぶたの筋肉) の皮下に埋め込まれ、筋電図 (EMG) 活動を記録し、眼窩周囲ショックを与えました。 ステンレス鋼の接地ネジを右頭頂骨に取り付け、コネクタ キャップに接続しました。 コネクタ キャップと接地ネジは、ステンレス鋼ネジと歯科用アクリルを使用して頭蓋骨に固定されました。 ラットは手術後 48 時間鎮痛剤 (カルプロフェン、5 mg/kg、皮下投与) で治療され、回復するまで 1 週間ホームケージ内に放置されました。

実験 2 では、ウイルスのインキュベーション後、ラットをイソフルランで麻酔し、定位固定フレームに配置しました。 頭蓋骨上の皮膚を引っ込め、RE (AP = − 2.1、ML = ブレグマから ± 2.0 mm) または MD (AP = − 2.6、ML = ブレグマから ± 2.1 mm) のいずれかの上で両側に穴を開けました。 ステンレス鋼フェルール（Ø2.5 mm、当社）に結合された光ファイバー（NA 0.48、コアサイズ 400 µm、FP400URT、当社）を、RE（AP = − 2.1、ML = ± 2.0、DV = − 7.3）のいずれかをターゲットにして移植しました。 15 度の角度でブレグマから mm）または MD（15 度の角度でブレグマから AP = − 2.6、ML = ± 2.1、DV = − 6.35 mm）。 光ファイバーは、ステンレス鋼のネジと歯科用アクリルを使用して頭蓋骨に固定されました。 次に、光ファイバーに保護ダストキャップ (Thorlabs) をかぶせました。 次に、実験 1 と同じプロトコルに従って、4 本のアイ ワイヤと接地ネジを備えたコネクタ キャップを取り付けました。移植後の外科的ケアは実験 1 と同じでした。

実験 1 では、行動パラダイムは合計 12 日間にわたって行われました。 最初の 2 日間は、ラットをコンディショニング チャンバーと手順に慣らすことに関係し、次の 10 日間は、瞬目微量条件付けの差次パラダイム (DTEBC1) のバージョン 1 でのトレーニングに関係しました。 馴化日 (H1 から H2) の間、ラットを音と光を減衰させるチャンバー内に収容された円筒形のプラスチック容器 (直径 21 cm) 内に、刺激を与えずに 50 分間入れました。 ３日目からラットにＤＴＥＢＣ１を受けさせ、２つの異なる試験タイプを与えた。 最初の試行タイプでは、音条件付き刺激 (TCS+、100 ミリ秒、2.5 kHz、85 dB) と、500 ミリ秒の刺激を挟んだ軽度のまぶたショック (無条件刺激 [US]、100 ミリ秒、100 Hz) が組み合わせられました。 -フリーインターバル。 2 番目の試行タイプでは、光条件刺激 (LCS-、100 ms、50 Hz) が単独で提示されました。 実験 1 では刺激のバランスをとらなかったが、実験 2 では、2 つの刺激のどちらが US とペアになっているかに関係なく、ラットがトーンと光を US と同等に関連付けることを確認した。 毎日のコンディショニング セッションは合計 100 回のトライアルで構成され、各トライアルは 50% の確率で TCS+ トライアルまたは LCS- トライアルのいずれかになります。 試験タイプの提示はランダム化されており、ラットには次にどの試験が提示されるか分からない。 試行間の間隔は 20 秒から 40 秒の間で擬似ランダム化され、平均は 30 秒でした。 各コンディショニング セッションは約 50 分間続きました。

刺激のタイミングと送達はマイクロコンピューター (Arduino Mega、Arduino) によって制御されました。 音刺激はチャンバー内の天井に取り付けられたスピーカーを介して提示され、光刺激はチャンバー側面の目の高さに設置された LED を介して提示され、US は埋め込まれたアイワイヤーを介してまぶたに送達されました。刺激アイソレーター (ISO-Flex、AMPI) によって駆動されます。 USショックレベルは最初に0.3mAに設定され、無条件反応（まばたき/頭の回転）を誘発するようにラットごとに個別に調整され、チャンバー内に取り付けられた赤外線カメラを通じて監視されました。

条件付け反応 (CR) は、US 発症直前の 200 ms ウィンドウ中に誘発されるまばたき反応として定義されました。 これと同じ時間枠が、米国が欠席した裁判でも使用された。 上記のパラメーターは、10 回のセッションにわたって、ラットが CR18,19 を発現する試験の割合が着実に増加することを示した以前の研究に基づいて選択されました。 まばたき反応は、外科的に埋め込まれた2本のステンレス鋼ワイヤーを介して左上部眼輪筋からのEMG活動を記録することによってモニタリングされました。 EMG 活動は 0.3 ～ 3.0 kHz でバンドパス フィルター処理され、6,102 Hz でデジタル化され、RZ-5 記録システム (Tucker-Davis Technologies) を使用して保存されました。

実験 2 では、行動パラダイムは合計 13 日間にわたって行われました。 最初の 2 日間には、ラットを条件付けチャンバーと手順に慣らすことが含まれ、3 日目にはナイーブ刺激反応テストが含まれ、続く 10 日間には、微量瞬き条件付けの差分パラダイム (DTEBC2) のバージョン 2 でのトレーニングが含まれました。 馴化 1 日目と 2 日目は、各セッションの時間が 75 分であったことを除いて、実験 1 と同じでした。 3日目（セッション0）、ナイーブ刺激反応試験のためにラットを条件付けチャンバー内に入れました。 ラットには 3 種類の試験が与えられ、タイプ 1 は中性光刺激 (TS) のみの提示、タイプ 2 は中性光刺激 (LS) のみの提示、タイプ 3 は US の提示を伴いました。自体。 セッション 0 は合計 150 のトライアルで構成され、各タイプに 50 のトライアルが割り当てられました。 ４日目（セッション１〜１０）から始めて、ラットはＤＴＥＢＣ２を受け、緊張強化（ＲＥラット５匹およびＭＤラット５匹）または光強化（ＲＥラット１匹およびＭＤラット２匹）のいずれかの条件付けで訓練された。 イントーン強化条件付けラットに 3 つの異なる試験タイプを与えました。 最初の試行タイプでは、ニュートラルトーン刺激が US と組み合わされ、500 ミリ秒の無刺激間隔で区切られました (条件刺激プラスおよび US [CS+US])。 2 番目の試行タイプでは、同じ音調刺激が単独で提示されました (条件刺激プラス [CS+])。 3 番目の試行タイプでは、中性光刺激のみが提示されました (条件刺激から [CS-] を差し引いたもの)。 光強化条件付けで訓練されたラットにも同様に 3 つの試験タイプがありました。 ただし、CS+US トライアルでは光とショックがペアになり、CS+ トライアルでは光のみが提示され、CS- トライアルではトーンのみが提示されるように、刺激のアイデンティティが交換されました。 毎日のコンディショニングセッションは合計 150 回のトライアルで構成され、CS+US トライアルは 68% の確率で発生し、CS+ および CS- トライアルはそれぞれ 16% の確率で発生しました。 セッション 0 およびセッション 1 ～ 10 では、各セッションは約 75 分間続き、試行間の間隔と試行タイプのランダム化は実験 1 と同様でした。

CS 単独の試験を含めることにより、US によって引き起こされる信号変化による汚染が存在せず、純粋に CS によって引き起こされる測光信号変化を調べることができました。 これにより、ラットが異なる刺激関連を形成するにつれて、CS 誘発活動の変化をより適切に測定できるようになりました。

すべての解析は、MATLAB (バージョン 2021a、Mathworks) で記述されたカスタム コードを使用して実行されました 18、19。 ラット当たりの各セッションについて、各 1 ms 時間ビン中の EMG 信号の振幅は、そのビン中の最大信号から最小信号を減算することによって計算されました。 EMG 振幅は、各試行における CS 発症前の 300 ms ウィンドウ中に平均されました。 ベースラインは、平均 EMG 振幅の中央値に 1 つの標準偏差を加えたものとして設定されました。 閾値を超える EMG 活動は、CS 発症前の 300 ミリ秒期間 (Pre-Value) と US 発症前の 200 ms ウィンドウ中 (CR 値) で平均されました。 CR 値は、US 発症の直前に発生する適応的まばたき反応を捕捉するように設計されました。 CR 値が事前値の 5 倍以上である場合、試験は CR 試験として定義されました。 Pre-Value が閾値の 30% を超えた試験は「過剰な」試験として分類され、破棄されました。 各試験タイプの条件付き応答のパーセント (CR%) は、その試験タイプの CR 試験の数をそのタイプの有効な試験の総数で割ったものです。 多動性試行の割合は、多動性として分類された試行の総数を試行の総数で割ることによって計算されました (実験 1: 多動性試行数/100、実験 2: 多動性試行数/150)。 特定の日の EMG 活動の時間的パターンを視覚的に描写するために、まず、EMG 振幅を各トライアルの Pre-Value で除算して正規化しました。 次に、その試験の正規化された EMG 振幅を、各ラットの同じ試験タイプのすべての有効な試験全体で平均し、さらに特定の日のラット全体で平均しました。 実験 1 では、最後のセッション中の各ラットの CR の開始までの潜時と CR のピークまでの潜時を計算することにより、EMG 活動の時間的パターンを調べました。 ラットが CR を示した試験のみを潜時解析に使用しました。 CS 発症の 300 ミリ秒前から始まる 1.3 秒ウィンドウ内の最初の EMG 振幅が各試行から抽出されました。 次に、EMG 値から Pre-Value (EMG-Pre) が減算され、最初の 300 ミリ秒のデータが平均化されて 5 倍されて、CR しきい値が生成されました。 次いで、ＣＲの開始までの潜時を、ＥＭＧ−Ｐｒｅ値がＣＲ閾値を超えた、ＣＳ終了後の５００ミリ秒ウィンドウ内の最初の時点として定義した。 CRのピークまでの潜時は、EMG-Pre値が最も高かった同じ500msウィンドウ内の時点として定義されました。 最後に、各試験の開始潜時とピーク潜時を、各ラットの同じタイプのすべての試験にわたって平均しました。

ラットには、馴化の 2 日目から開始して DTEBC1 の 10 日間すべてを通して、割り当てられた溶液の頭蓋内注入が与えられました。 柔軟なプラスチックコーンに拘束されたラットに、条件付けの開始の 20 分前に注射を行った。 注入は、ムシモール臭化水素酸塩溶液 (0.5 mL 人工脳脊髄液 [aCSF]、G019 Sigma-Aldrich に 0.5 mg) または aCSF のいずれかから構成されました。 合計 500 nl を 1 分間かけて注入しました。 その後、抽出前にさらに 1 分間、注入カニューレを所定の位置に置いたままにしました。 薬物濃度、注入量、および注入速度は、ムシモールの拡散がカニューレ先端から最大 1 mm の範囲に限定されることが判明した以前の研究に基づいて選択されました 47,48。 ムシモル群は合計8匹のラットであったが、aCSF対照群は合計9匹であった。

REおよびMD内の前頭前終末の測光記録は、励起光が送達され、放出された蛍光が捕捉される単一の光ファイバーを介してバルク蛍光を測定することによって行われた。 381 Hz で変調された 465 nm LED を使用して GCaMP6f を刺激し、カルシウム依存性の蛍光を発しました。 221 Hz で変調された 405 nm LED を使用して GCaMP6f を刺激しました。 励起等吸収波長で、カルシウムに依存しない蛍光を発します。 変調は、RZ5 録音システム (Tucker Davis Technologies) を介して実行されました。 両方の LED からの光は、統合された蛍光ミニ キューブ (IFMC、ドーリック レンズ) に結合され、結合されたファイバー パッチ コード (NA 0.48、コア サイズ 400 μm、ドーリック レンズ) に両方の光ストリームを出力します。 次に、パッチコードは、不透明なジルコニアスリーブ（Thorlabs）を使用して、埋め込まれた光ファイバーおよびフェルールアセンブリと嵌合されました。 パッチコードの先端で測定した両方の LED の出力は 60 µW (PM100D、Thorlabs) でした。 動物から発せられた蛍光は、パッチコードを通って、フェムトワット受光器（Doric Lenses）に接続されたIFMCに伝わりました。 次に、受光器からの出力は RZ5 記録システムに供給され、出力が 1 kHz で復調およびサンプリングされました。 実験 2 では、測光記録は 2 日目から 13 日目まで行われました。各セッションは 75 分間続いたため、各セッション内の光退色を最小限に抑えるために、刺激に時間ロックされた短時間だけ LED をオンにしました。 2 日目 (Hab 2) では、LED を 30 秒ごとに 9 秒間オンにしました。 3 日目 (セッション 0) に、TS、LS、および US の開始の 4 秒前に LED がオンになり、各試行で 9 秒間オンのままになりました。 4 日目から 13 日目 (セッション 1 から 10) では、CS の発症の 4 秒前に LED がオンになり、各試行で合計 9 秒間オンのままになりました。 条件付けされた最初の 2 匹のラットでは、セッション 0 中の US 分娩時に少量のアーチファクトが検出されましたが、このアーチファクトは TS にも LS にも見られませんでした。 CS に対する端末応答のその後の分析と一致して、セッション 0 で TS と LS によって引き起こされたアクティビティのみを分析することを選択しました。

カスタム作成された MATLAB コードを使用して、405 nm 刺激からの蛍光活性を使用して、モーション アーチファクトと光退色を補正しました。 まず、蛍光出力は LED の開始から 2 秒以内に安定したため、9 秒間の LED オン時間の最後の 7 秒からの 465 nm と 405 nm の信号が各試行から抽出されました。 次に、最小二乗線形フィット手法を使用して 405 nm シグナルを 465 nm シグナルにフィットさせ、ΔF/F を次のように計算しました: (465 nm シグナル - フィットした 405 nm シグナル) / フィットした 405 nm シグナル。 得られたΔF/F値は、各試験におけるCS発症の2秒前と5秒後のカルシウム活性を表した。 次に、ΔF/F 値は、そのセッションの同じトライアル タイプを共有するすべてのトライアルにわたって平均されました。

RE または MD 内の前頭前終末における CS 誘発カルシウム活性を描写するために、CS 発症の 2 秒前から始まる 6 秒ウィンドウの ΔF/F 値を最初に試験タイプに基づいてグループ化し、次に値を各セッションの試験全体で平均しました。 異なる CS タイプに対する ΔF/F 応答を比較するために、各ラットの各セッションの 2 秒間の試験平均 ΔF/F 値を合計することにより、曲線下面積 (AUC) 値を計算しました。 ベースライン AUC の場合、ウィンドウは CS の開始の 2 秒前に始まりましたが、CS 応答 AUC の場合、ウィンドウは CS の終了から始まりました。 次いで、各セッションにおけるラット全体のAUC値を平均した。

行動試験が終了したら、過剰量のペントバルビタールナトリウム（80 mg/kg、Bimeda）でラットを深く麻酔しました。 最初に冷却した 0.9% 生理食塩水で経心的に灌流し、続いて冷却した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を灌流しました。 脳を抽出し、4% PFA 内に 4℃で 2 時間浸漬した後、リン酸緩衝生理食塩水 - 30% スクロース溶液 (PBS-Suc) に 48 時間浸漬しました。 mPFC、RE、および MD の前後方向全体にわたる冠状脳スライス (45 μm) を、クライオスタット (CM3050S、Leica Biosystems) を使用して収集しました。 組織切片は、組織保存緩衝液 (PBS-Suc およびエチレングリコール溶液) を満たしたチューブに保存し、すべてのチューブを -20 °C で保存しました。 注入カニューレの位置を特定するために、組織をスライドガラス上に載せ、クレシルバイオレットで染色した。 Cytoseal 280 マウント ソリューション (#8311–4、Thermo Fisher Scientific) の薄層をカバーガラスと一緒に塗布しました。 スライドを光学顕微鏡(Leica DM400b)で観察した。 光ファイバーの配置を特定するために、組織をスライドガラス上にマウントし、Cytoseal とカバーガラスを使用して密封しました。 スライドを正立蛍光顕微鏡 (Zeiss AxioImager 2.0) で観察しました。 次に、カニューレと光ファイバーの位置が、ラットの脳の定位アトラスからプレート上に描かれました 49。 実験 1 では RE を正確に標的とするカニューレを備えたラットのみが使用され、実験 2 では RE または MD を正確に標的とする光ファイバーを備えたラットのみが使用されました。

実験 1 (RE の薬理学的不活性化) のサンプルサイズは、TEBC7、16、17 を使用した以前の行動研究に基づいています。 同様に、実験 2 (測光) のサンプル サイズは、以前の論文 16、17、18 で局所電場電位データを報告するために使用されたサンプル サイズに基づいています。 データは、グループ平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表されました。 統計分析は、MATLAB および SPSS 統計ソフトウェア (IBM) を使用して実行されました。 統計的有意性を判断するために、一元配置反復測定分散分析 (ANOVA)、二元配置混合/反復測定分散分析、三元混合分散分析、1 サンプル t 検定、対応のある t 検定および対応のない t 検定、線形検定を使用しました。回帰分析とピアソン相関。 有意性は *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 として定義されました。

まず、CR獲得に対するREの薬理学的不活性化の影響を調べることにより、REがDTEBCにおける刺激関連の形成に必要であることを確認しようとしました。 2日間の慣れセッションの後、22匹のラットに10回の獲得セッションを受けさせ、その間、音刺激はUS（TCS+）とペアになり、光刺激（LCS-）は単独で提示されました（図1a）。 各獲得セッションの前に、GABAA受容体アゴニストであるムシモールを11匹のラット（ムシモール群）のREに注入し（図1b）、他の11匹には人工脳脊髄液の注入を受けました（対照群）。 カニューレの標的を誤ったために5匹のラットが取り除かれ、ムシモール群に8匹のラット、対照群に9匹のラットが残されました（図1c）。 10回のコンディショニングセッションにわたって、対照群はCRを発現したTCS+試験の割合を徐々に増加させました（図1d）。 対照と比較して、ムシモルグループはより少ない数のTCS+試験でCRを発現しました（図1d、三元混合分散分析、セッション×グループ×CSタイプ相互作用、F（9,135）= 2.299、p = 0.020。フォローアップ2- TCS+ 試験の混合方式分散分析、セッション、F(9,135) = 21.037、p < 0.001; グループ、F(1,15) = 8.266、p = 0.012; セッション × グループ交互作用、F(9,135) = 3.264、p = 0.001 ）。 具体的には、ムシモルグループはセッション 7 で発現した CR の数が有意に低かったのに対し (多重比較用に補正された対応のない t 検定、t15 = 4.026、p = 0.001)、セッション 5 ～ 6 およびセッション 8 ～ 10 では CR 発現が低くなる傾向が見られました。 (p = 0.005–0.054)。 並行して、両方のグループは、LCS 試験で発現された CR の数のわずかな増加を示しました。 ただし、CR 発現頻度は対照群よりもムシモールで高かった（LCS 試験の追跡二元配置混合分散分析、セッション、F(9,135) = 2.362、p = 0.016; グループ、F(1,15) = 5.063、p = 0.040; セッション × グループの相互作用、F(9,135) = 0.930、p = 0.502)。 さらに、最後の 3 日間で、両グループは LCS- 試験と比較して TCS+ で高い CR% を示しました (過去 3 日間の平均 CR% に関する二元配置混合分散分析、グループ × CS タイプの交互作用、F(1,15) ) = 8.732、p = 0.010; CS タイプ、F(1,15) = 85.170、p < 0.001; グループ、F(1,15) = 4.845、p = 0.044)。 多重比較用に補正されたフォローアップの対応のない t 検定により、TCS+ 試験ではムシモール群の CR% が対照群と比較して有意に低かった（t15 = 2.665、p = 0.018）一方、LCS- 試験の CR% は群間で同等であった（t15 = 0.018）ことが明らかになりました。 − 1.421、p = 0.176)。 さらに、ムシモール群は、CS発症直前に飛び跳ねたり、立ち上がったり、毛繕いを示した試行回数の点で対照群と差がありませんでした（図1e、二元配置混合ANOVA、セッション×グループ交互作用、F） (9,135) = 1.144、p = 0.336; セッション、F(9,135) = 1.765、p = 0.081; グループ、F(1,15) = 0.539、p = 0.474)、RE阻害がベースライン活動レベルに影響を与えなかったことを示しています。 これらの発見は、RE阻害がラットの刺激連合を形成する能力を損なうことを示唆している。 ただし、光の刺激から音を区別する能力は影響を受けませんでした。

RE の可逆的な不活性化は差動連合学習を損ないますが、刺激弁別は損ないません。 (a) 行動パラダイム。 2 種類のトライアルがランダムに混合され、50 分間続くセッションで提示されました。 (b) 条件反射 (CR) は、左眼輪筋 (まぶた) の筋電図 (EMG) 活動を記録することによって検出されました。 REを標的として微量注入カニューレを移植した。 (c) 左 3: 最終分析に含まれたすべてのラットの RE 内のカニューレ先端位置の組織学的再構成。 黒と赤のバーは、それぞれコントロール (N = 9) およびムシモール グループ (N = 8) の注入カニューレの位置を示します。 上部の番号は、ブレグマからの前方後方 (AP) 座標を示します。 右: RE の代表的なセクション。 （ d ）ラットが TCS+ および LCS- に対する CR を発現した試験の割合（* p < 0.05、グループ × CS タイプの相互作用）。 エラーバーは平均値の±標準誤差 (SEM) を示します。 (e) 過剰活動試験の割合 (平均 ± SEM)。 (f) セッション 10 の平均正規化 EMG 振幅。青と緑の長方形は、それぞれ TCS+ と LCS- の提示を示します。 黒い四角は米国でのプレゼンテーションを示します。 網掛け部分は±SEMを示します。

RE阻害が条件付きまばたき反応の時間的パターンに影響を与えたかどうかを調べるために、最後のセッションでの両方のグループとCSタイプの平均統合CRを示しました（図1f）。 対照群と比較して、TCS+試験における平均EMG振幅はムシモール群で低く、発現されたCRの数が減少していることをさらに裏付けました（図1f上）。 ただし、平均 EMG 振幅の時間的パターンは 2 つのグループ間で同等でした。 CR 発症までの潜時（対照群：238 ± 36 ミリ秒、ムシモール グループ： 226 ± 41 ミリ秒、対応のない t 検定、t15 = 0.225、p = 0.825）、および CR 発症までの潜伏時間については、群間で差は見られませんでした。ピーク (対照グループ: 448 ± 10 ミリ秒; ムシモール グループ: 411 ± 17 ミリ秒; t15 = 1.917、p = 0.074)。 同様に、LCS 試験では、発症までの潜伏期間（対照群：192 ± 39 ミリ秒、ムシモール グループ：241 ± 57 ミリ秒、t15 = − 0.723、p = 0.481）およびピークまでの潜伏期間について群間で差は見られませんでした。 (対照群: 434 ± 17 ミリ秒; ムシモール グループ: 416 ± 23 ミリ秒; t15 = 0.674、p = 0.510)。 したがって、RE阻害は発現するCRの数を減少させましたが、CRの全体的な時間的パターンには影響を与えませんでした。

REの完全性が刺激関連の形成に必要であることを確立したので、次に、ラットが眼瞼ショックと関連付けられたとき、REおよびMD内の前頭前終末が刺激にどのように反応するかを調査しました。 この目的を達成するために、ウイルスベクターをmPFCに両側から注入して、mPFCニューロン内で遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター（GCaMP6f.）を発現させました（図2a）。 RE または MD 内の末端の活動は、RE または MD に慢性的に埋め込まれた光ファイバーを通じて監視されました (各領域につき 9 匹のラット)。 GCaMP6fの発現。 は、両半球のmPFCの辺縁前（PrL）領域に局在し、隣接する前帯状皮質（ACC）および辺縁下皮質内での発現は最小限でした（IL、図2b）。 18 匹のラットのうち、4 匹のラットは光ファイバーの標的を誤ったために除去され、1 匹のラットは行動条件付け中に内部ファイバーコアの破損により除去されました。 これにより、RE内の末端を標的とする光ファイバーを備えた合計6匹のラット（REグループ）と、MDを標的とするファイバーを備えた7匹のラット（MDグループ、図2c）が残されました。 したがって、実験 2 におけるその後のすべての分析は、これらのラットに対してのみ実行されました。 465 nmのカルシウム依存シグナルが405 nmのカルシウム非依存シグナルとは著しく異なることを確認しました（図2d）。 これら 2 つの信号から計算された ΔF/F 値により、光退色やモーション アーティファクトによる汚染を差し引いたカルシウム過渡現象を調べることができました (「方法」を参照)。

RE内の前頭前終末は、記憶の性質を欠いた感覚刺激によっては活性化されません。 (a) GCaMP6f を発現する前頭前 (辺縁前領域 [PrL]) 末端。 REまたはMD内に記録されています。 (b) GCaMP6f を示す mPFC の組織学的再構成および代表的な切片。 表情（緑）。 ウイルス注入は両側性でした。 両半球の広がりを表示するために、半球を重ね合わせました。 番号はブレグマからの AP 座標を示します。 略語: 前帯状皮質 (ACC)、下辺縁皮質 (IL)。 (c) 上: RE および MD における光ファイバー先端の配置の組織学的再構成。 下: 拡大された領域内の代表的なセクション。 番号はブレグマからの AP 座標を示します。 （ d ）緊張の提示中の代表的なラットのMD内の前頭前終末の測光記録からの代表的なカルシウム依存性（465nm）および独立性（405nm）信号。 2 本の垂直線はトーンの開始と終了を示します。 破線は±SEM (N = 25 プレゼンテーション) を示します。 （ e ）ラット全体で平均した、セッション0の刺激に対する前頭前部終末反応。 影付きの領域は±SEM (RE、N = 6 ラット; MD、N = 7 ラット) を示します。 （ f ）セッション0のベースラインおよびCS誘発AUCは、それぞれCS提示の直前および直後の2秒ウィンドウ内のΔF / F値の合計によって計算されました（ * p < 0.05、対ベースライン）。 エラーバーは±SEMを示す(RE、N = 6ラット; MD、N = 7ラット)。

まず、条件付けの前に 2 つの中立的な感覚刺激に対する最終反応を調査しました。 ２日間の馴化セッションの後、ラットはプレコンディショニング刺激試験の１セッション（セッション０）を受けた。これには、音（ＴＳ）刺激または光（ＬＳ）刺激が単独で提示される試験が含まれた。 セッション0中、TSとLSの両方の提示は、MD内の前頭前終末からの強力で明確に定義された反応を引き起こしましたが、REの末端反応は弱く、ベースライン活動と区別するのが困難でした（図2e）。 これらの反応がベースライン活動よりも有意に大きいかどうかを定量化するために、CS 発症前後の 2 秒間の ΔF/F 値の曲線下面積 (AUC) を計算しました。 ベースラインの活動と比較した場合、RE内の端末はTSまたはLSのいずれかの提示によって有意に活性化されていないことがわかりました（図2f左、二元配置反復測定[RM] ANOVA、期間×CSタイプ相互作用、F( 1,5) = 0.391、p = 0.559; 期間、F(1,5) = 1.700、p = 0.249; CS タイプ、F(1,5) = 0.112、p = 0.751)。 逆に、MD内の端末は両方の刺激によって強く活性化されました（図2f右、二元配置RM ANOVA、期間×CSタイプ相互作用、F（1,6）= 1.112、p = 0.332;期間、F（1） ,6) = 10.061、p = 0.019; CS タイプ、F(1,6) = 0.125、p = 0.736)。 これらの発見は、記憶の性質を持たない新しい感覚刺激は、REではなくMD内の前頭前終末を強く活性化することを示唆しています。

セッション 0 の後、ラットを DTEBC2 で 10 日間にわたって条件付けしました (図 3a)。 このトーンは 10 匹のラットの CS+ として使用され、そのうちの 5 匹には RE をターゲットとする光ファイバーがあり、残りの 5 匹には MD がターゲットされました。 残りの 1 匹と 2 匹のラットでは、それぞれ RE と MD に光ファイバーを備えた光を CS+ として使用しました。 10回の条件付けセッションにわたって、13匹のラットすべてがCRを発現するCS+USおよびCS+試験の割合を徐々に増加させた。 CS 試験における CR の数は低いままでしたが（図 3b、二元配置 RM ANOVA、セッション × CS タイプ交互作用、F(18,216) = 18.418、p < 0.001; セッション、F(9,108) = 36.220、p < 0.001; CS タイプ、F(2, 24) = 72.052、p < 0.001)。 過去 3 日間の CR% は、CS- 試験と比較して CS+US および CS+ 試験で有意に高かった (過去 3 日間の平均 CR% に対する一元配置 RM 分散分析、CS タイプ、F(2,24) = 185.663、p < 0.001。多重比較用に補正された対応のある t 検定 CS- 対、CS+US: t12 = 16.541、p < 0.001; CS+ : t12 = 13.524、p < 0.001)。 CS+US 試験と CS+ 試験の間に CR% の差はありませんでした (多重比較のために補正された対応のある t 検定、t12 = 0.385、p = 0.707)。 コンディショニング最終日の平均積分 CR を検査すると、実験 1 と同様のまばたき反応の時間的パターンが明らかになりました (図 3c)。

測光記録時の動作。 (a) 行動パラダイム。 3 種類のトライアルがランダムに混合され、75 分間続くセッションで提示されました。 (b) 3 つの試験タイプのそれぞれでラット (N = 13) が CR を発現した試験の割合 (*p < 0.05、セッション × CS タイプの交互作用)。 エラーバーは±SEMを示します。 (c) セッション 10 の平均正規化 EMG 振幅。灰色の四角形は CS の提示を示します。 ピンクのトレース (CS+US) の高振幅領域は、US の送達によって引き起こされたアーチファクトを表しています。 網掛け部分は±SEMを示します。

毎日のコンディショニングセッション中に、6匹のラットのRE内の前頭前終末のカルシウム活性を記録しました（図4a）。 RE内の端末は、最初の数セッションでは同様の大きさでCS+とCS-に応答したことがわかりました（図4b、c）。 条件付けが進むにつれて、CS+ は徐々に強い反応を引き起こしました。 一方、CS-に対する反応は弱まり、その後全体を通して低いままでした。 日をまたいだ応答の変化をより適切に定量化するために、CS 終了直後の 2 秒間のウィンドウ中の ΔF/F 値を合計することによって AUC を計算しました。 CS+誘発反応はCS-よりも有意に大きいことがわかりました（図4d、二元配置RM ANOVA、セッション×CSタイプ相互作用、F（9,45）= 2.839、p = 0.010;セッション、F（9、 45) = 0.695、p = 0.709; CS タイプ、F(1,5) = 47.743、p = 0.001)。 追跡線形回帰分析により、CS+誘発反応は、6匹のREラット中5匹で条件付けの日数を重ねるごとに大きさが増大し(5匹のラット p < 0.05、1匹のラット p = 0.411)、逆に、CS-では有意な効果は見られなかったことが明らかになった。誘発反応 (ラット 6 匹、p > 0.05)。

RE内の前頭前終末におけるCS+誘発活動の大きさは、刺激関連の形成と並行して増加します。 (a) GCaMP6f を発現する前頭前 (辺縁前領域 [PrL]) 末端。 RE内に記録されています。 (b) 左: コンディショニングの最初の 3 日間の平均 ΔF/F 値。 右: 左と同じですが、最後の 3 日間のコンディショニングのもの。 黒い垂直線は、CS の開始と終了を表します。 網掛け部分は±SEMを示します。 （ c ）左：数日間のコンディショニングにわたるCS +に応答したRE内の前頭前終末の平均ΔF / F値（y軸、上から下に降下）を時間（x軸）に対してプロットしました。 垂直の白い線は、CS+ の開始と終了を表します。 右: 左と同じですが、CS- 用です。 （ d ）コンディショニング日数に対してプロットされた、CS 提示直後の 2 秒ウィンドウの平均 AUC（*p < 0.05、セッション × CS タイプの交互作用）。 エラーバーは±SEMを示します。

7匹のラットからなる別のコホートでは、毎日のコンディショニングセッション中にMD内の前頭前終末のカルシウム活性を記録しました（図5a）。 MD内の前頭前終末は、最初のセッションからCS-よりもCS+に対して強い反応を示しました（図5b、c）。 CS+ と CS- の間の応答の大きさの違いは、その後のセッションでより顕著に現れました。これは主に CS+ に対する応答の増加によるものです。 ただし、これらの視覚的な印象は、AUC値に適用された統計分析では確認されませんでした（図5d、二元配置RM ANOVA、セッション×CSタイプ交互作用、F（9,54）= 0.869、p = 0.586;セッション、F (9,54) = 1.530、p = 0.161; CS タイプ、F(1,6) = 9.000、p = 0.024)。 我々の発見は、CS+はCS-と比較してREとMDの両方に対してより大きな前頭前野出力を誘発したが、この出力の進化は2つの脳領域間で異なっていたことを示唆している。 主に、REへの前頭前野の出力は数日間のコンディショニングを通して強化されましたが、MDへの出力は最初のコンディショニング日にCS+でより強くなり、その後の数日間にわたって安定して維持されました。

CS+は、コンディショニングの最初のセッションから開始して、CS-と比較してMD内の前頭前終末においてより大きな活動を引き起こしました。 (a) GCaMP6f を発現する前頭前 (PrL 領域) 末端。 MD内に収録されていました。 (b) 左: コンディショニングの最初の 3 日間の平均 ΔF/F 値。 右: 左と同じですが、最後の 3 日間のコンディショニングのもの。 黒い垂直線は、CS の開始と終了を表します。 網掛け部分は±SEMを示します。 （ c ）左：数日間のコンディショニングにわたるCS +に応答したMD内の前頭前終末の平均ΔF / F値（y軸、上から下に下降）を時間（x軸）に対してプロットしました。 垂直の白い線は、CS+ の開始と終了を表します。 右: 左と同じですが、CS- 用です。 （ d ）コンディショニングの日数に対してプロットされた、CS 提示直後の 2 秒ウィンドウの平均 AUC（* p < 0.05、CS タイプの主効果）。 エラーバーは±SEMを示します。

RE と MD の前頭前野出力の違いをより直接的に比較するために、コンディショニングの最後の 3 日間で平均した刺激誘発 AUC を、コンディショニング前の刺激誘発 AUC で割りました (セッション 0)。 この正規化された AUC は、連合学習の前後での CS によって誘発された終末活動の相対的な変化を定量化しました。 CS+誘発反応の変化は、MD内の端末よりもRE内の端末の方が有意に大きかった（図6a、二元配置混合ANOVA、グループ×CSタイプの相互作用、F（1,11）= 4.942、p = 0.048。グループ、F(1,11) = 2.297、p = 0.158; CS タイプ、F(1,11) = 10.508、p = 0.008。フォローアップの対応のない t 検定、t11 = 2.320、p = 0.041)。 対照的に、CS 誘発応答の変化は、RE 内の端末と MD 内の端末間で同等でした (t11 = 0.535、p = 0.603)。 これらの発見は、刺激関連の形成により、MD よりも RE に対する前頭前野出力が大きく増加したことを示唆しています。

CS+US 関連の形成には、MD と比較して RE 内の前頭前終末における CS+ 誘発活動の強力な増加が伴います。 (a) RE (N = 6) と MD (N = 7、*p < 0.05) 内の前頭前終末間の CS+ および CS- 誘発 AUC の比較。 AUC は、コンディショニングの最後の 3 日間で平均され、セッション 0 の CS 誘発 AUC 値を使用して正規化されました。 エラーバーは±SEMを示します。 (b) 2 匹の代表的なラットにおける CS 誘発 AUC と CR% の相関関係。 各プロット内のドットは、10 セッションすべてにわたる同じ試験タイプの AUC 値に対してプロットされた CS+ または CS- 試験の CR% を表します。 上：REファイバーラット。 下: MD ファイバーラット (*p < 0.05)。 （e）CR％とAUCの間の平均相関係数の比較（RE、N = 6; MD、N = 7）。 エラーバーは±SEMを示します。

前頭前野の視床出力と連合学習の関係をさらに厳密にするために、10 回のコンディショニングセッションにわたる両方の CS タイプの AUC 値と CR% の間のピアソン相関係数 (r) を計算しました。 6匹のREラットのうち、3匹は反応の大きさとCR％の間に有意な（p < 0.05）正の相関を示しました（図6b）。 7 匹の MD ラットのうち、3 匹は有意な正の相関を示しました。 グループとして（図6c）、R値はRE（1サンプルt検定、t5 = 3.720、p = 0.014）およびMDグループ（t6 = 9.056、p = 0.001）の両方でゼロから有意に異なりました。 R 値も RE グループと MD グループ間で同等でした (対応のない t 検定、t11 = 0.713、p = 0.491)。 したがって、REおよびMDへの前頭前野出力は刺激関連に対して選択的であった。 ただし、REへの前頭前野出力のみが、学習との連合選択性の大きな改善を示しました。

行動研究からの証拠の蓄積により、RE、特に mPFC から RE 経路が、mPFC と HPC 間の密接なコミュニケーションに依存する記憶形成プロセスにおいて重要な役割を果たしていることが示されています 22,23,24。 しかし、以前の研究では、REへのmPFC出力が課題刺激の感覚的および関係的特徴によってどの程度調節されるかは調査されていませんでした。 REで終わる前頭前部投射の活動をモニタリングすることにより、刺激が嫌悪結果と関連するようになった後にのみ、前頭前野終末活動が刺激によって強く活性化されることが判明した。 刺激によって引き起こされる終末活動の大きさは、学習された刺激の関連性の強さと正の相関がありました。 さらに、学習に関連した終末反応の増加は、別の視床出力ターゲットである MD よりも RE の方が大きかった。 これは、連合学習中の感覚刺激の行動的関連性に関連するルーティング情報における mPFC から RE 経路の独特の役割を強調しています。

私たちの測光記録は、RE内の前頭前終末が、それ自体によって提示された聴覚および視覚刺激に反応して活性化されないことを実証しました（セッション0;図2e、f）。 しかし、学習とともに、それらはまぶたショックと組み合わせられた刺激の1つによって強く活性化されましたが、単独で提示された他の刺激によっては活性化されませんでした（図4d）。 これらの発見は、mPFCからREへの出力で検出された変化は連合学習に起因するものであるが、繰り返し提示された感覚刺激に対する感作に起因するものではないことを示唆しています。 同様の異なる活動パターンが、mPFC 振動 17,18 およびスパイク活動 12,14,15,50,51 についても以前に報告されています。 さらに、この異なる活性を強化する操作は、刺激関連の形成を促進します 16,17。 まとめると、これらの発見は、mPFC が関連する刺激の関連性の検出とコード化において重要な役割を果たしていることを示唆しています 52。 今回の発見は、検出された関連性が RE にルーティングされることを実証することで、この概念を拡張します。

REが薬理学的に不活性化された場合、ラットは刺激と嫌悪結果との関連を形成できませんでしたが、単独で提示された他の刺激に対する反応は増加しませんでした（図1d）。 これらのパターンは、RE が刺激連合の形成には必要であるが、感覚弁別には必要ではないことを示しています。 今回の観察は、ムシモル 53 または高周波電気刺激 40 による RE 摂動が、それぞれ恐怖と瞬目条件付けにおける記憶獲得を損なうという以前の報告と一致している。 同時に、REを不活性化しても、ラットは依然としてわずかな程度の連合学習を示した。 これは、RE が注入したムシモールの広がりを超えて前後軸を超えて広範囲に広がっているため、RE の不活性化が不完全な結果である可能性があります。

感覚事象の行動的関連性に対するREの前頭前投射の選択性を考慮すると、RE阻害後に観察された学習障害は、HPCがmPFC関連性信号から剥奪されたことに起因する可能性がある。 あるいは、RE 阻害は、時間連合学習において重要な役割を果たすことが知られている mPFC と HPC の間の神経活動の同期を妨害する可能性もあります 19,54。 ウレタン麻酔したラットでは、RE の不活性化により、ガンマバースト (GB) の時間的パターン形成と mPFC と CA1 の間の同時性の両方が破壊されました。 ただし、両方の地域でのこれらの GB の発生頻度は影響を受けませんでした 30。 より最近では、DTEBC のトレース間隔中の mPFC GB の発生率がタスク獲得と正の相関があることを発見しました 18。 同様のGBがCA1でも同時に発生した場合、RE阻害によりそれらの同期が乱れ、mPFC-HPC通信の中断につながる可能性があります。 さらに、mPFCからREへの投影を選択的に阻害しなかったため、RE阻害による学習障害は、REを介した背側HPCからmPFCへの情報伝達および/または調節効果の中断による可能性があります。

情報ゲートにおけるその役割と並行して、文脈的恐怖条件付けタスクを使用するいくつかの研究では、RE が文脈的恐怖記憶の精度も制御すると主張しました 35,36,37,38。 具体的には、RE への mPFC 出力の不活性化、または RE 投影の直接的なサイレンシングは、元の条件付けコンテキストに対する選択性を欠いた恐怖記憶の獲得につながりました 35。 特に、REが不活性化されていた期間中に獲得された不正確な文脈記憶は、海馬とは独立して獲得される36。 状況的恐怖条件付けでは、海馬機能が低下した被験者は、フットショックと単純な環境合図との要素的な関連性を形成しますが、条件付け環境の詳細な表現とは関連性を形成しないため、状況特異性が失われます55,56。 したがって、メモリ精度の制御における RE の明らかな役割は、メモリ エンコーディングにおける HPC の関与を調整する際の RE のより一般的な役割の 1 つの現れである可能性があります 36。 このアイデアは、私たちのタスクで観察された学習障害とよく一致します。 具体的には、TEBC では、CS と US の間の時間的なギャップを埋めるために HPC が必要ですが、これは低レベルの学習戦略を適用することで回避することはできません 1、2、3。 したがって、RE阻害は、コンディショニング中にHPCに適切に関与することができなかったため、CR獲得の障害を引き起こしました（図1d）。 私たちの測光データは、RE のこの機能が進行中のイベントの関連性を通知する mPFC 出力によって制御されていることを示唆することで、この考えをさらに拡張しました。

MD は mPFC41、42、43 と相互に接続されていますが、HPC44、45 への、または HPC45 からの投影がありません。 この解剖学的特徴により、MD と RE の前頭前野出力を対比することができ、MD への mPFC 投影に特有のいくつかの性質が明らかになりました。 まず、条件付けが始まる前に、MDの前頭前終末が感覚刺激によって強く活性化されました。 第二に、条件付けが開始されると、ラットが差次的なCRを発症する前に、MDへの前頭前野出力はCS+とCS-の間で区別されました（図3bおよび5d）。 さらに、その後のコンディショニング セッションでは、応答の大きさは増加しませんでした。 これらの発見に基づいて、さまざまな形式の作業記憶タスクで提案されているように、mPFC と MD の間のループは、刺激と結果の間隔中に mPFC 内の刺激表現を維持するのに役立つと主張します45、57、58、59、60、61、62。 たとえば、mPFC 内の MD 端子は、T 迷路タスクをサンプリングするための遅延不一致の遅延期間中に mPFC ニューロンを持続的に発火させるために必要です 57。 さらに、後続のルールベースの選択選択のために遅延期間にわたって感覚手がかりを維持する必要がある別の WM タスクでは、遅延期間の MD 活動が手がかり選択性 mPFC ニューロンからの入力に依存することが判明しました 58,61。 これらの研究は、行動に関連した情報を維持する上での mPFC への MD 投影の重要性と、このプロセスを開始するための刺激誘発 mPFC 出力に対する MD の依存性を強調しています。 これに基づいて、動物はその刺激が記憶へのコミットメントを正当化するのに十分な行動的関連性があるかどうかを評価するために刺激を活性状態に保つ必要があるため、新規の刺激またはおそらく関連する刺激はMDへのmPFC出力を誘発するはずです。 この見解は、TEBC63 において、MD 病変のあるウサギは、病変のない対照と比較して、刺激関連性を形成するためにより多くの条件付けセッションを必要とした一方、追跡間隔がない遅延まばたき条件付けのパフォーマンスは最小限にとどまるという研究結果とも裏付けられています。仮にあったとしても、影響を受ける64,65。

今回の我々の発見は、REへの前頭前野出力の学習誘発性の増加を明らかにすることにより、2つの主要な前頭前野-視床経路間の機能的解離を特定し、REへ出力される情報が感覚刺激の関係的特徴の信号であることを示した。 今後の研究では、どのような種類の情報が RE から HPC に送信され、それが時間連合学習をサポートする海馬の神経処理にどのように影響するかを調査する必要があります。

この研究で生成および分析されたすべてのデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Solomon、PR、Vander Schaaf、ER、Thompson、RF & Weisz、DJ 海馬と、ウサギの古典的に条件付けされた瞬膜反応のトレース条件付け。 振る舞い。 神経科学。 100、729–744 (1986)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Moyer, JR、Deyo, RA & Disterhoft, JF 海馬切除術はウサギの微量の瞬目条件付けを破壊する。 振る舞い。 神経科学。 104、243–252 (1990)。

論文 PubMed Google Scholar

Weiss, C.、Bouwmeester, H.、Power, JM & Disterhoft, JF 海馬の病変は、自由に動くラットにおける痕跡の瞬き条件付けを妨げます。 振る舞い。 脳解像度 99、123–132 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マサチューセッツ州クロンフォースト・コリンズおよびジョン・F・ディスターホフト ウサギの内側前頭前皮質の尾部の病変は、痕跡の瞬きの条件付けを損なう。 ニューロビオール。 学ぶ。 メム。 69、147–162 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Weible, AP、McEchron, MD & Disterhoft, JF 微量のまばたき条件付けの獲得と消滅における皮質の関与。 振る舞い。 神経科学。 114、1058–1067 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

McLaughlin, J.、Skaggs, H.、Churchwell, J. & Powell, DA 内側前頭前野とパブロフ条件付け: トレース条件付けと遅延条件付け。 振る舞い。 神経科学。 116、37–47 (2002)。

論文 PubMed Google Scholar

Takehara-Nishiuchi, K.、Kawahara, S. & Kirino, Y. 内側前頭前野における NMDA 受容体依存プロセスは、トレース中の獲得と強化の初期段階に重要ですが、まばたきの条件付けを遅らせるものではありません。 学ぶ。 メム。 12、606–614 (2005)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Woodruff-Pak, DS、Lavond, DG & Thompson, RF トレースコンディショニング: 小脳核損傷によって廃止されるが、小脳皮質側方吸引によって廃止されない。 脳解像度 348、249–260 (1985)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Takehara, K.、Kawahara, S. & Kirino, Y. まばたき条件付けにおける記憶保持の基礎となる脳コンポーネントの時間依存性再構成。 J. Neurosci. 23、9897–9905 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McEchron, MD & Disterhoft, JF 非空間トレースコンディショニングの海馬エンコーディング。 海馬 9、385–396 (1999)。

3.0.CO;2-K" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291098-1063%281999%299%3A4%3C385%3A%3AAID-HIPO5%3E3.0.CO%3B2-K" aria-label="Article reference 10" data-doi="10.1002/(SICI)1098-1063(1999)9:43.0.CO;2-K">論文 CAS PubMed Google Scholar

Green、JT & Arenos、JD ラットにおける遅延および微小瞬目条件付け中の海馬および小脳の単一ユニット活動。 ニューロビオール。 学ぶ。 メム。 87、269–284 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

Takehara-Nishiuchi, K. & McNaughton, BL 固定化中の連想記憶のための新皮質コードの自発的変化。 サイエンス 322、960–963 (2008)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Siegel, JJ、Kalmbach, B.、Chitwood, RA & Mauk, MD 皮質から皮質下への回路における持続的な活動: まぶたの調整の痕跡における一時的なギャップを埋める。 J. Neurophysiol. 107、50–64 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Siegel, JJ & Mauk, MD トレースまぶたのコンディショニング中の前頭前皮質の持続的な活動: 小脳の出力を反映する反応とそうでない反応との解離反応。 J. Neurosci. 33、15272–15284 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hattori, S.、Yoon, T.、Disterhoft, JF & Weiss, C. 微量の瞬き条件付けの統合を媒介する前頭前皮質ネットワークの機能的再編成。 J. Neurosci. 34、1432–1445 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Volle, J. et al. 前頭前ニューロンの活動を強化すると、時間的に異なるイベントの連合学習が可能になります。 Cell Rep. 15、2400–2410 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jarovi, J.、Volle, J.、Yu, X.、Guan, L. & Takehara-Nishiuchi, K. 前頭前部シータ振動は、行動に関連するイベントの選択的エンコードを促進します。 eNeuro 5、(2018)。

Yu, XT、Yu, J.、Choi, A. & Takehara-Nishiuchi, K. 外側嗅内皮質は、時間的に不連続な刺激を橋渡しする前頭前野ネットワーク活動の発達をサポートします。 海馬 31、1285–1299 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

タンニネン、SE et al. 嗅内タウの病理は、連合学習中の海馬と前頭前野の振動結合を破壊します。 ニューロビオール。 58歳、151～162歳（2017年）。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Laroche, S.、Davis, S. & Jay, TM 海馬から前頭前野シナプスへの可塑性: 作業記憶と固定化における二重の役割。 海馬 10、438–446 (2000)。

3.0.CO;2-3" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1098-1063%282000%2910%3A4%3C438%3A%3AAID-HIPO10%3E3.0.CO%3B2-3" aria-label="Article reference 20" data-doi="10.1002/1098-1063(2000)10:43.0.CO;2-3">論文 CAS PubMed Google Scholar

Malik, R.、Li, Y.、Schamiloglu, S. & Sohal, VS 前頭前野の長距離抑制による海馬の S/N のトップダウン制御。 セル 185、1602-1617.e17 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アイヘンバウム、H. エピソード記憶における前頭前野と海馬の相互作用。 ナット。 神経科学牧師。 18、547–558 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Dolleman-van der Weel、MJ 他視床の再会核は、海馬と内側前頭前皮質回路の結合部に位置し、記憶と行動を可能にします。 学ぶ。 メム。 26、191–205 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferraris, M.、Cassel, J.-C.、Pereira de Vasconcelos, A.、Stephan, A. & Quilichini, PP 再会核、最近および遠隔記憶の固定化における皮質 - 海馬相互作用のための視床中継器。 神経科学。 生物行動。 改訂 125、339–354 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vertes, RP、Hoover, WB、Szigeti-Buck, K. & Leranth, C. 視床正中核の再結合核: 内側前頭前皮質と海馬の間のリンク。 脳解像度ブル。 71、601–609 (2007)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoover, WB & Vertes, RP ラットの視床再結合核から海馬および内側前頭前皮質への側副投影: 単一および二重逆行性蛍光標識研究。 脳の構造。 機能。 217、191–209 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Varela, C.、Kumar, S.、Yang, JY & Wilson, MA 海馬、内側前頭前皮質、および視床核間の直接相互作用のための解剖学的基質。 脳の構造。 機能。 219、911–929 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hallock, HL、Wang, A. & Griffin, AL 腹側正中視床は、海馬と前頭前野の同期性と空間作業記憶に重要です。 J. Neurosci. 36、8372–8389 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Roy, ​​A.、Svensson, FP、Mazeh, A. & Kocsis, B. シータリズムとデルタ帯の 2 ～ 5 Hz 振動による前頭前野と海馬の結合: 視床の再会核の役割。 脳の構造。 機能。 222、2819–2830 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

フェラーリ、M. 他再会核は、低速振動中の長距離の海馬と前頭前部のガンマ同期を制御します。 J. Neurosci. 38、3026–3038 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Davoodi, FG、Motamedi, F.、Akbari, E.、Ghanbarian, E. & Jila, B. 受動的回避課題における記憶処理に対するレユニエンス核の可逆的不活性化の影響。 振る舞い。 脳解像度 221、1–6 (2011)。

論文 PubMed Google Scholar

チョルビン、T.ら。 腹側正中視床は、前頭前皮質と海馬の両方の機能を必要とする記憶課題における戦略変更に貢献します。 J. Neurosci. 33、8772–8783 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

伊藤、HT、Zhang、S.-J.、Witter、MP、Moser、EI、および Moser、M.-B。 目標指向の空間ナビゲーションのための前頭前部-視床-海馬回路。 ネイチャー 522、50–55 (2015)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Maisson, DJ-N.、Gemzik, ZM & Griffin, AL 再会核の光遺伝学的抑制は、空間作業記憶中の符号化を選択的に損なう。 ニューロビオール。 覚えておいてください。 155、78–85 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Xu, W. & Südhof, TC 記憶の特異性と一般化のための神経回路。 サイエンス 339、1290–1295 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramanathan, KR、Ressler, RL、Jin, J. & Maren, S. 核再結合は、ラットの海馬に依存する正確な文脈上の恐怖記憶を符号化して取得するために必要です。 J. Neurosci. 38、9925–9933 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Troyner, F.、Bicca, MA & Bertoglio, LJ 視床の再会核は、恐怖記憶の強さ、特異性、そして固定化中の長期的な維持を制御します。 海馬 28、602–616 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウー、Y.-T. & チャン、C.-H. 機能的再会と菱形核は、痕跡恐怖条件付けにおける手がかり恐怖と文脈恐怖の適切な獲得と発現に必要である。 内部。 J. Neuropsychopharmacol. https://doi.org/10.1093/ijnp/pyab094 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャヤチャンドラン、M. 他前頭前経路は、一連の出来事に対する記憶のトップダウン制御を提供します。 Cell Rep. 28、640-654.e6 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eleore, L.、López-Ramos, JC、Guerra-Narbona, R. & Delgado-García, JM 連合学習における内側前頭前皮質および海馬錐体 CA1 野へのレユニエンス核投射の役割。 PLoS ONE 6、e23538 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krettek, JE & Price, JL ラットの背背核と隣接する視床核の皮質突起。 J.コンプ。 ニューロール。 171、157–191 (1977)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Groenewegen, HJ ラットの視床内背核の求心性接続の組織。背背前頭前部のトポグラフィーに関連する。 神経科学 24、379–431 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vertes、RP ラットの辺縁下皮質と辺縁前皮質の差動投影。 シナプス 51、32–58 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wyss, JM、Swanson, LW & Cowan, WM ラットの海馬形成に対する皮質下求心性神経の研究。 神経科学 4、463–476 (1979)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mitchell, AS & Chakraborty, S. 視床内側背筋は何をするのですか? フロント。 システム。 神経科学。 7、37 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wood、GE & Shors、TJ ストレスは男性では古典的条件付けを促進しますが、女性では卵巣ホルモンの活性化効果により古典的条件付けを損ないます。 手順国立アカド。 科学。 95、4066–4071 (1998)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morrissey, MD、Maal-Bared, G.、Brady, S. & Takehara-Nishiuchi, K. 時間的に不連続な刺激間の関連性を記憶検索するための嗅内皮質内の機能的解離。 J. Neurosci. 32、5356–5361 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タンニネン、SE et al. 側方嗅内皮質のコリン作動性受容体は、NMDA ではなく、微量の瞬目条件付けの獲得を媒介します。 海馬 25、1456–1464 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Paxinos, G. & Watson, C (1997) 定位座標におけるラットの脳 - 第 6 版。 サンディエゴ: アカデミックプレス https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coowned/paxinos/978-0-12-374121-9

Baeg、EH et al. 高速スパイクと規則的なスパイクは、ラットの内側前頭前皮質における恐怖条件付けの神経相関を示します。 セレブ。 Cortex 11、441–451 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gilmartin, MR & McEchron, MD 海馬の歯状回と CA1 の単一ニューロンは、痕跡恐怖条件付け中に逆パターンのコード化を示します。 振る舞い。 神経科学。 119、164–179 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

Takehara-Nishiuchi, K. 新しい記憶の符号化中の前頭前野と海馬の相互作用。 脳神経科学。 上級 4、2398212820925580 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リン、Y.-J.、チオウ、R.-J. & チャン、C.-H. レユニエンス核および菱形核は、ラットにおけるパブロフ痕跡恐怖条件付けの獲得に必要である。 eNeuro 7(3) (2020)。

Klee, JL、Souza, BC & Battaglia, FP 学習は、古典的条件付け中の前頭前野と海馬の活動を異なって形成します。 Elife 10、e65456 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maren, S.、Aharonov, G. & Fanselow, MS ラットにおける背側海馬の神経毒性病変とパブロフの恐怖条件付け。 振る舞い。 脳解像度 88、261–274 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rudy、JW & O'Reilly、RC 文脈恐怖条件付け、結合表現、パターン補完、および海馬。 振る舞い。 神経科学。 113、867–880 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ボルカン、SS et al. 視床の投影は、作業記憶の維持中に前頭前野の活動を維持します。 ナット。 神経科学。 20、987–996 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rikhye, RV、Gilra, A. & Halassa, MM 皮質表現間の切り替えに関する視床の調節により、認知の柔軟性が可能になります。 ナット。 神経科学。 21、1753–1763 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rikhye, RV、Wimmer, RD & Halassa, MM 視床機能の統合理論に向けて。 アンヌ。 神経科学牧師。 41、163–183 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Marton, TF、seifikar, H.、Luongo, FJ、Lee, AT & Sohal, VS 課題への取り組みと行動の柔軟性における前頭前皮質と視床内側背筋の役割。 J. Neurosci. 38、2569–2578 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シュミット、LI et al. 皮質接続の視床増幅は注意制御を維持します。 ネイチャー 545、219–223 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Parnaudeau, S.、Bolkan, SS & Kellendonk, C. 視床内側背筋: 認知にとって前頭前皮質の重要なパートナー。 バイオル。 精神医学 83、648–656 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Powell, DA & Churchwell, J. 視床内背側病変は、ウサギにおける微量の瞬き条件付けを損なう。 学ぶ。 メム。 9、10–17 (2002)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchanan, SL & Thompson, RH ウサギにおける視床内背側病変と心拍数と瞬き反応のパブロフ条件付け。 振る舞い。 神経科学。 104、912–918 (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Buchanan, SL、Penney, J.、Tebbutt, D. & Powell, DA 最適とは言えない刺激条件下での視床背背核の病変と古典的な瞬き条件付け：部分的な強化と刺激間間隔の役割。 振る舞い。 神経科学。 111、1075–1085 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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この研究は、NSERC Discovery Grant (RGPIN-2020-04479) および CFI Leaders Opportunity Fund (25026; [KT-N.])、および NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral Program (PGSD2-535097; [XY]) によって支援されました。 。

トロント大学、細胞およびシステム生物学部、トロント、カナダ

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

ヒューマン生物学プログラム、トロント大学、トロント、カナダ

ジェンベレサンド

トロント大学心理学部、トロント、カナダ

Kaori Takehara-Nishiuchi

神経科学共同プログラム、トロント大学、トロント、カナダ

Xiaotian Yu & Kaori Takehara-Nishiuchi

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XY と KT-N による実験デザイン。 すべての手術と実験はXYが実施し、FJが組織学を支援した。 すべてのデータは KT -N の指導を受けて XY によって分析されました。 XY と KT -N によって書かれた原稿の初稿。 著者全員が編集した原稿。 XYとKT -Nが作成した最終原稿。

Correspondence to Kaori Takehara-Nishiuchi.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Yu, X.、Jembere, F. & Takehara-Nishiuchi, K. 連合核への前頭前投射は、連合学習中の刺激の行動的関連性を示します。 Sci Rep 12、11995 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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受信日: 2022 年 5 月 2 日

受理日: 2022 年 6 月 30 日

公開日: 2022 年 7 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15886-0

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