新生マウスにおけるプレベッツィンガー複合体の吸気ニューロンの単一細胞トランスクリプトーム配列決定

Scientific Data volume 9、記事番号: 457 (2022) この記事を引用

1047 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

脳幹プレベッツィンガー複合体 (preBötC) のニューロンは、吸気呼吸運動のリズムと基本的な運動パターンを生成します。 我々は、in vitro で呼吸関連のリズム性を保持する新生仔マウススライスの preBötC の吸気ニューロンから全細胞パッチクランプ記録を実行しました。 私たちは、電気生理学的特性と遺伝的背景に基づいてニューロンを分類し、単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) のために細胞内容物を吸引しました。 このデータセットは、生のヌクレオチド配列 (FASTQ ファイル) と、マウスゲノムにマッピングされたヌクレオチド配列の注釈付きファイル (Ensembl の mm10) を提供します。これには、フラグメント数、遺伝子長、および 100 万マッピングされたリードあたりの転写産物の 1 キロベースあたりのフラグメント (FPKM) が含まれます。 ）。 これらのデータは、吸気呼吸運動のリズムとパターンを生成するニューロンのトランスクリプトームを反映しています。

測定

ヌクレオチド配列

テクノロジーの種類

イルミナシーケンシング

因子の種類

遺伝子型: マウスプレベッツィンガー複合体の Dbx1 由来ニューロンと非 Dbx1 由来ニューロン • 電気生理学的特性: タイプ 1 とタイプ 2 の吸気プレベッツィンガー複合体ニューロン

サンプルの特徴 - 生物

マウスの筋肉

サンプル特性 - 環境

実験室環境

サンプルの特徴 - 場所

アメリカ合衆国本土

呼吸の容赦ない活発な段階は吸気であり、横隔膜の降下と肋骨の上昇により肺が拡張されて空気が取り込まれます1。 インスピレーションのリズムは、プレベッツィンガー複合体 (preBötC) と呼ばれる下部脳幹部位から発せられます2,3,4。 preBötC の核となるリズム形成要素は、ホメオボックス遺伝子発達中の脳ホメオボックス 1 (Dbx1) を発現する前駆細胞に由来する介在ニューロンであり、以下、Dbx1 ニューロンと呼びます 5、6、7、8、9、10。 Dbx1 ニューロンはまた、吸気リズムを出力パターンとしてポンプ筋と気道筋の運動前ニューロンと運動ニューロンに伝達します 11,12。 吸気は、律動性ニューロンのみに起因すると考えられる吸気前段階から始まります11、13、14。 それらの活動が閾値に達すると、吸気バーストが発生し、運動出力のパターンに影響を与えて伝達するニューロンを動員します13、14、15。 リズム生成ニューロンとパターン生成ニューロンは、preBötC の Dbx1 ニューロン集団の 2 つのサブセットです。

リズム発生器とパターン発生器は電気生理学的に区別できます。 タイプ 1 ニューロンは律動性であると推定されています。 これらは、大規模な吸気バーストの開始の 300 ～ 500 ミリ秒前に、シナプス電位のランプ状の合計によって活性化します 16,17。 1 型ニューロンは、A 型過渡 K+ 電流 (IA) を発現します。 IA を遮断すると、in vitro で吸気リズムと全体的な吸気前活動が不安定になります 18。 タイプ 2 ニューロンは、出力パターンの生成に特化していると推定されています。 これらは Type-116,17 よりも約 300 ms 遅く活性化し、過分極活性化混合カチオン電流 (Ih) を発現します。その操作はモーター出力に影響します 19。

全細胞パッチクランプ記録中に、タイプ 1 ニューロンとタイプ 2 ニューロンを電気生理学的に区別しました。 タイプ間の差異は十分に特徴づけられているにもかかわらず、一部のニューロンはあいまいな生理機能を示し、確実に分類することができません。 私たちはそれらを未知と呼んでいますが、それらはpreBötCにあり、in vitroでインスピレーションと同調してリズミカルに活動しているため、呼吸にとって重要であると考えています。 私たちは細胞質内容物を取得し、10 個のサンプルに対して次世代 RNA シーケンシングを実行しました。4 つのタイプ 1 ニューロン（3 つは Dbx1 発現前駆体から、1 つは Dbx1 レポーターを持たない CD-1 野生型マウスから取得）、1 つのタイプ 2 ニューロンDbx1 を発現する前駆体、および CD-1 野生型マウスからの 5 つの未知のニューロンから。 2 か月以内にすべてのニューロンが記録され、RNA が抽出され、一緒に次世代シーケンスに送られました。

William & Mary の施設内動物管理使用委員会は、実験動物福祉局 (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) の方針および米国研究評議会のガイドラインに準拠したこれらのプロトコルを承認しました20。 CD-1 マウス (Charles River、ウィルミントン、マサチューセッツ州) および遺伝子改変マウス (後述) を 23 °C で 14 時間明/10 時間暗サイクルで維持し、水を自由に摂取させて自由に給餌しました。

実験には、CD-1 マウスまたは Dbx1;Ai148 と名付けられた交差マウス モデルを使用しました。 交差モデルの命名法に関して、最初の部分は、Dbx1 プロモーターによって駆動される Cre リコンビナーゼを発現する Dbx1Cre マウス (IMSR Cat# EM:01924、RRID:IMSR_EM:01924) を指します。 2 番目の部分、Ai148 (IMSR Cat# JAX:030328、RRID:IMSR_JAX:030328) は、Allen Brain Institute によって作成された Cre レスポンダー マウスを指します。このマウスは、フロックス化対立遺伝子の Cre 媒介組換え後に蛍光 Ca2+ インジケーター GCaMP6f を発現します 22。 私たちは、Dbx1Cre 雌マウスと Ai148 雄マウスを交配し、Dbx1 由来ニューロンで GCaMP6f 発現を持つ子孫を作製しました。

各実験の前に、RNase ZAP (Thermo Fisher、Waltham、MA) を使用してすべての作業スペースを清掃しまし​​た。 器具とガラス製品はオートクレーブ処理するか、RNase ZAP で洗浄してから、ヌクレアーゼフリー水 (NFW) ですすぎました。

認可された米国獣医師会（AVMA、イリノイ州シャンバーグ）ガイドラインバージョン2020.0.1の指示に従って、CD-1またはDbx1;Ai148の子犬（生後0〜3日、つまりP0〜3）を低体温で麻酔しました。クリエイティブ・コモンズ表示 - 非営利 - 改変禁止 3.0 に基づいています。 橋から頸髄までの神経軸を 2 分で除去し、以下を含む氷冷人工脳脊髄液 (aCSF) (mM 単位): 124 NaCl、3 KCl、1.5 CaCl2、1 MgSO4、25 NaHCO3、0.5 の中に入れました。 NaH2PO4、および30ブドウ糖。 aCSF は RNase フリーの環境で事前に調製され、実験全体を通じて 95% O2 と 5% CO2 でバブリングされました。 神経軸を切り取って脳幹を分離し、寒天ブロックの背側表面に接着し、95％通気した氷冷aCSFで満たしたビブラトーム（Campden Instruments 7000 smz-2、レスター、英国）内の万力に配置した。 % O2 および 5% CO2。 吻側表面に preBötC を付けた厚さ 450 ～ 500 μm の横スライスを切り出しました 23。 細胞質遺伝子内容の分解と汚染を避けるために、スライスは 3 時間以内に使用されました。

図 1a (上) は、電気生理学のワークフローを示しています。 生理学顕微鏡 (Zeiss Axio Examiner、Carl Zeiss AG、オーバーコッヘン、ドイツ) の記録チャンバー内で、スライスを aCSF (28 °C) で 2 ～ 4 ml/分で灌流しました。 aCSF の外部 K+ 濃度は、堅牢な呼吸リズムと舌下 (XII) 運動出力を促進するために 3 mM から 9 mM に上昇しました 4,24。 オートクレーブ処理したホウケイ酸ガラス ピペット (外径: 1.2 mm、内径: 0.68 mm) で製造した吸引電極を使用して XII モーターの出力を記録しました。最初は Flaming-Brown P-97 マイクロピペット プラー (Sutter Instruments、カリフォルニア州ノバト) で引っ張り、次にファイアーポリッシュしました。直径約 100 μm まで。 XII モーター出力は、差動アンプ (EX1、Dagan Instruments、ミネソタ州ミネアポリス) を使用して 2,000 倍に増幅され、0.3 ～ 1 kHz でバンドパス フィルター処理され、アナログ二乗平均平方根フィルター (Analog Devices、Norwood) を使用して表示用に平滑化されました。 、MA) を使用して、全波整流および平滑化された XII 波形を提供します。 Dbx1;Ai148 マウスのスライスでは、全細胞パッチクランプ記録を取得する前に、XII 出力と同期したリズミカルな蛍光変化に基づいて吸気 Dbx1 preBötC ニューロンを同定しました。 CD-1 マウスでは、全細胞記録を確立した後、XII 運動出力と同期して活性化する吸気 preBötC ニューロンを同定しました。 Flaming-Brown P-97 マイクロピペットプーラーの 4 段階プログラムを使用して、オートクレーブ処理したホウケイ酸ガラス (OD: 1.5 mm、ID: 0.86 mm) からパッチ ピペットを製造しました。 先端抵抗は 3 ～ 5 MΩ と測定されました。 RNase フリーの環境で混合した内部溶液をパッチ ピペットに充填しました。次の内容 (mM 単位): 123 K-グルコン酸塩、12 KCl、10 HEPES、0.2 EGTA、4 Mg-ATP、0.3 Na-GTP、10 Na2-ホスホクレアチン、13グリコーゲン。 内部（パッチ）溶液の浸透圧を 260 ～ 270 mOsm に調整し、pH を 7.25 に維持しました。 RNA を保存するために、各実験の直前に 1 ～ 2.5% の組換えリボヌクレアーゼ阻害剤 (RRI) (Takara Bio USA、カリフォルニア州マウンテンビュー) を内部溶液に添加しました。 ロボットマイクロマニピュレーター（Sensapex、ヘルシンキ、フィンランド）を使用して、視覚制御下で吸気ニューロンに隣接してパッチピペットを配置しました。 PATCHMASTER ソフトウェア (RRID:SCR_000034) を備えた EPC-10 パッチクランプアンプ (HEKA Instruments、マサチューセッツ州ホリストン) を使用して、全細胞パッチクランプ記録を実行しました。

実験計画の概略図。 (a) Patch-Seq ワークフロー。 リズム的に活性な Dbx1 由来の preBötC ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成で記録されます (VM、上のトレース)。 舌下脳神経 (XII) は、吸気関連の運動出力を表します (下のトレース)。 a_i – a_iv は、「メソッド」で詳しく説明されているように、Patch-Seq ワークフローのステップをグラフィックで表します。 (b) フローチャート b_i – b_v は、「方法」で詳述されているバイオインフォマティクスのワークフローを示しています。

我々は、吸気駆動潜時を、吸気バースト間の静止膜電位からニューロンを脱分極させる興奮性シナプス電位の合計（EPSP）の開始から吸気バーストの開始までの経過時間として定義しました。 吸気駆動潜時は、ニューロンがタイプ 1 かタイプ 2 かを判断するために部分的に使用されました (図 1ai)。 タイプ 1 preBötC ニューロンは 300 ミリ秒を超える吸気駆動潜時を示しますが、タイプ 2 の preBötC ニューロンは 100 ミリ秒程度の吸気駆動潜時を示します (図 2a 左と b 左を比較)。

preBötC ニューロンの電気生理学的プロファイル。 (a) 長い吸気駆動潜時 (左)、興奮の遅延 (中央)、および「サグ」電位の欠如 (右) を特徴とするタイプ 1 ニューロン。 (b) 吸気駆動潜時が短い (左)、興奮の遅延がない (中央)、サグ電位の存在 (右) を特徴とするタイプ 2 ニューロン。

–70 mV の保持電位から持続時間 500 ms の閾値超過脱分極電流ステップ コマンドを適用することにより、タイプ 1 preBötC ニューロンの特徴である A タイプ K+ 電流 (IA) をテストしました。 IAを発現するタイプ1のpreBötCニューロンは120〜220ミリ秒の遅延興奮を示しましたが、IAを発現していないタイプ2のpreBötCニューロンは、同様の脱分極電流ステップコマンドに応答して遅延興奮を示さなかった16、17、25（図2a、中央と2を比較してください）。 b、中央）。

持続時間 400 ～ 500 ms の過分極電流ステップ コマンドを適用して、過分極活性化カチオン電流 (Ih) をテストしました。これにより、保持電位 -50 mV から -20 mV を超える初期電圧変動が発生しました。 Ihを発現するタイプ2のpreBötCニューロンは、時間および電圧依存性の脱分極「サグ」を示しましたが、Ihを発現していないタイプ1のpreBötCニューロンは、同様の過分極電流ステップコマンドに応答してサグ電位を示しません16、17、25（図2aを比較してください） 、右対 b、右）。

図 1a (下) は、細胞質内容物を取得し、次世代シーケンシングに適した相補 DNA (cDNA) ライブラリを作成するためのワークフローの概略を示しています。 吸気駆動潜時およびIAおよびIhの発現またはその欠如に基づいてニューロンをタイプ1またはタイプ2のいずれかに分類した後、 またはそれらを不明として分類し、0.7 ～ 1.5 psi の負圧によって細胞内容物を抽出しました (図 1aii)。 パッチピペットを素早く引っ込め、2% RRI を含む 4 μL のヌクレアーゼフリー水が入った RNase フリー PCR チューブの底でピペットの先端を折ることによってピペットの内容物を排出しました。 サンプルは短時間遠心分離され、液体窒素に浸して直ちに凍結され、-80 °C で保存されました。 抽出した RNA を、SMART-Seq v4 (Takara Bio USA) のシーケンシングプロトコル用の超低入力 RNA キットに従って cDNA に変換しました (図 1aiii)。 第一鎖 cDNA は、サーマルサイクラー (42 °C で 90 分間、70 °C で 10 分間) で逆転写を行うことにより合成されました。 次に、95℃で1分間、98℃で10秒間、65℃で30秒間、68℃で3分間を17サイクルでcDNAを増幅しました。 72℃で10分間。 PCR増幅したcDNAをAMPureビーズ(Beckman Coulter、Brea、CA)上に固定化することによって精製し、ビーズからcDNAを溶出する前に80%エタノールで洗浄しました。 増幅された cDNA は、Agilent 2100 Bioanalyzer および Agilent の高感度キット (5067-4626、Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して検証されました。 1500 ～ 2000 塩基対の範囲で 20 蛍光単位の閾値を超え、100 ～ 500 塩基対領域にピークがほとんどまたはまったくないサンプル (例、図 1aiii) を、Qubit dsDNA 高感度アッセイ キットを使用して定量しました。 (Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)。 cDNA 濃度が 150 pg/μL を超えるサンプルは、次世代シークエンシングのために保存されました 26。 Nextera Library Preparation Kits (FC-131-1024、Illumina、San Diego、CA) を使用して完全長 cDNA を処理し、Illumina HiSeq を使用した次世代シーケンシング用の cDNA ライブラリーを取得しました。 ペアエンド (150 bp) リードを備えた 4000 シーケンシング システム (図 1aiv)。 研究者らは、ライブラリーの構築と配列決定中に細胞の種類について知らされていませんでした。

図 1b は、バイオインフォマティクスのワークフローの概略図を示しています。 まず、FastQC v0.11.8 を使用して読み取りの品質を検証しました (図 1bi)。 アダプター読み取り (読み取り 1: TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG、読み取り 2: GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG) は、bbduk v38.00 を使用して次のコマンドを使用してトリミングされました (図 1bii)。

sh bbduk.sh in1 = inputFASTQFile1.fastq。 in2 = inputFASTQFile2.fastq out1 = OutputFASTQFile1.fastq out2 = OutputFASTQFile2.fastq ktrim = r -Xmx27g mm = fk = 33 hdist = 1 リテラル = TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG,GTCTCGTGGGCTCGGAG ATGTGTATAAGAGACAG tbo tpe

Ensembl (欧州分子生物学研究所ファミリーの欧州バイオインフォマティクス研究所) の mm10 マウス参照ゲノムを使用して、次のコマンドを使用して STAR27 v2.7.7a でリードをアライメントするためのゲノム ディレクトリを作成しました。

STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir mm10ReferenceGenome --genomeFastaFiles Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Mus_musculus.GRCm38.102.gtf --sjdbOverhang 149 -- genomeSAsparseD 2

次に、以下のコマンドを使用して、STAR v2.7.7a27 によって配列を mm10 参照ゲノムにアラインメントしました (図 1biii)。

STAR --genomeDir mm10ReferenceGenome --readFilesIn inputFASTQFile1.fastq inputFASTQFile2.fastq -- outFileNamePrefix OutputBAMFile --outSAMtype BAM SortedByCoowned --outReadsUnmapped Fastx

featureCounts v2.4.2 を使用して、検出された遺伝子のフラグメント数を定量しました (図 1biv)。 さらに、統計コンピューティング環境「R」でカスタム スクリプト (以下の「コードの可用性」を参照) を開発し、遺伝子の長さ、フラグメント数、FPKM を含むテキスト ファイルを生成しました。これらのファイルは NCBI GEO で入手できます (図 1bv)。

ヌクレオチド配列で構成される生データ (FASTQ ファイル) と、mm10 へのアライメント後の処理データの生フラグメント数 (GSE175643_fragmentCounts.txt.gz)、フラグメントで表される遺伝子の FPKM 値 (GSE175643_fpkm.txt.gz) 、mm10 の遺伝子の長さ (GSE175643_geneLength.txt.gz) は、NCBI GEO データベース (GEO:GSE175643) で公開されています 28。

Figshare に寄託された「新生児マウスにおける吸気前ベッツィンガー複合体ニューロンの電気生理学的特性 (GEO:GSE175643)」というファイルは、データセット内の各サンプル preBötC ニューロンの電気生理学的プロファイルを示しています 29。 Figshare に寄託された「新生児マウスの吸気前ベッツィンガー複合ニューロンのヌクレオチド配列のマッピング統計 (GEO:GSE175643)」というファイルは、mm10 参照ゲノムにマッピングされたリード数とその長さに関する STAR からの一連の統計を提供します 29。

Bioanalyzer High Sensitivity キット (Agilent、Santa Clara、CA) および Qubit dsDNA High-sensitivity Assay Kit (Molecular Probes) を使用して、cDNA の平均サイズと存在量を検証しました。 ヌクレオチド配列の生データとその対応する品質スコア (FASTQ 形式) は、NCBI GEO データベース (GEO:GSE175643) で公開されています。

品質スコアに関しては、20 件の FastQC レポート (10 サンプルの preBötC ニューロンの 2 つのペアエンド リード) のすべてで、配列ごとの品質スコアが平均 38 ～ 40 でした。 どのシーケンスも低品質としてフラグを立てられませんでした。

ここで説明されているトランスクリプトーム データは、Kallurkar et al. で分析されたデータと同じ技術を使用して収集されました。 Sci Rep、12:2923、2022。これは 17 個の Dbx1 preBötC ニューロン (タイプ 1 が 7 個、タイプ 2 が 9 個、不明が 1 個) で構成されていました 25。 以下、これらのデータを「Kallurkar 2022」と呼びます。 ただし、現在のデータは約 1.5 年前に収集され、配列決定のために送信されたものであるため、これら 2 つのデータセット間に変動を引き起こす可能性のあるバッチ効果をテストしたいと考えました。 バッチ効果の不均衡をスクリーニングするために、Kallurkar 2022 と現在のデータセットのサンプルの 3 分の 2 以上（つまり、合計 27 個のうちのいずれか 19 個）で非ゼロ発現を示す 8,916 個の遺伝子の対数発現を要約する各サンプルの箱ひげ図 30 を作成しました。サンプル）。 これらの 8,916 個の遺伝子は、mm10 参照ゲノム内の 55,367 個の遺伝子の 16% に相当します。 図 3 は、Kallurkar 2022 (灰色の箱ひげ図、サンプル 1 ～ 9 および 11 ～ 18) と現在のデータ (黒い箱ひげ図、サンプル 1 ～ 10) 全体で、log10 (FPKM) 中央値が約 1.0 で推移していることを示しています。 下位四分位と上位四分位にまたがる箱ひげ図の長さは、通常 10 年 (FPKM の 10 倍) ですが、30 年 (FPKM の 1000 倍) に及ぶものもあります。 ただし、現在のデータセットのサンプル 1 ～ 4 は、log10(FPKM) の中央値が 0.5 未満であり、ボックスの長さが 30 年であることを示しています。 これらの統計は、サンプル 1 ～ 4 は、Kallurkar 2022 およびサンプル 5 ～ 10 と比較して、検出された遺伝子の一部について発現レベルが低く、変動性が高いことを示しています。 発現レベルと変動性をさらに調査するために、log10(FPKM)の中央値とlog10(FPKM)の絶対偏差中央値(MAD)をプロットしました(図4)。 サンプル 1 ～ 4 (数字付き黒丸) は、サンプル 5 ～ 10 (黒丸) および Kallurkar 2022 (白丸) と比較して左上に位置しており、これも遺伝子発現が低く、変動性が高いことと一致しています。 最後に、Kallurkar 2022 と現在のデータの log10(FPKM) のヒストグラムを調べました (図 5)。 Kallurkar 2022 (灰色の線) は、サンプル 5 ～ 10 (黒い実線) および現在のデータセットのサンプル 1 ～ 4 の最高ピーク (黒い破線) とよく重なっています。 ただし、サンプル 1 ～ 4 では、-2 付近の log10(FPKM) の分布に別のピークが示されており、サンプル 1 ～ 4 の高い変動の原因となっている一連の低発現遺伝子が示されています。 特に、サンプル 1 ～ 4 は、4 つすべてが 150 pg/μL の基準を満たしていましたが、Qubit 定量化によると最も低い cDNA 濃度を示しました26。 サンプル 1 ～ 4 の中央値 log10(FPKM) は、サンプル 5 ～ 10 および Kallurkar 2022 より 10 分の 1 低くなります (図 5、縦線)。

Kallurkar et al., 2022 (参考文献 25) または本報告書の 10 サンプルのいずれかからの preBötC ニューロンの 19 トランスクリプトームで発現された 8,916 個の遺伝子の発現レベルを示すボックスプロット。 Kallurkar 2022 データセットはサンプル 1 ～ 9 および 11 ～ 18 (灰色の箱ひげ図) です。 現在のデータセットはサンプル 1 ～ 10 (ブラック ボックス プロット) です。 中央値 log10(FPKM) は箱ひげ図の中央にある目玉の点で示され、上位四分位数と下位四分位数が示されます。 ドットは、四分位範囲外の遺伝子発現レベルを示します。

Kallurkar et al., 2022 (参考文献 25) (白丸）または本レポートの 10 個のサンプル（黒丸）。 MAD が高く、発現中央値が低いサンプル 1 ～ 4 は、サンプル名に対応する数字でさらに示されます。

Kallurkar et al., 2022 (参考文献 25) (灰色の実線) または本レポートの 10 サンプル (黒い破線) のいずれかからの preBötC ニューロンの少なくとも 19 のトランスクリプトームで発現される 8,916 個の遺伝子の遺伝子発現レベルの確率を示すヒストグラムサンプル 1 ～ 4 の場合は黒の実線、サンプル 5 ～ 10 の場合は黒の実線）。 最初のビンの高さ (0.13、0.05、および 0.09) は、Kallurkar 2022 および現在のデータセットで発現されていない mm10 遺伝子の割合に対応します。

さらに、マッピング統計によって現在のデータを Kallurkar 2022 と比較しました。 ゼロの割合（つまり、検出されなかった mm10 の遺伝子の割合）は、現在のデータでは 0.775 でしたが、Kallurkar 2022 では 0.762 でした。Figshare に寄託されたファイルは、「新生児マウスの吸気前ベッツィンガー複合体ニューロンのヌクレオチド配列のマッピング統計 ( GEO:GSE175643)」には、mm10 マウス参照ゲノムに独自にマッピング、マルチマッピング、またはマッピングされていないヌクレオチド配列の詳細なマッピング統計がリストされています 30。 Kallurkar 2022 のマッピング統計は、ref に関連付けられています。 25. 簡単に言うと、0.85 ± 0.04 は mm10 に独自にマッピングされた現在のデータセットからの配列の割合を表し、0.05 ± 0.02 はマルチマッピングされた割合を表し、0.10 ± 0.03 はマッピングされていない割合を表します。 Kallurkar 2022 では、0.56 ± 0.14 は mm10 に一意にマッピングされた配列の割合を表し、0.04 ± 0.01 はマルチマッピングされた割合を表し、0.16 ± 0.07 はマッピングされていない割合を表します。

さらに、Kallurkar 2022 の品質レポートと現在のデータは、「塩基ごとのシーケンス品質」について同様のスコアを返し、35 以上であり、低品質としてフラグが立てられた配列はなかったことにも注目します。

全体として、対数発現箱ひげ図と追跡分析では、Kallurkar 2022 と現在のデータセットの間の主要な技術的差異は排除されていますが、サンプル 1 ～ 4 で検出された遺伝子の一部は、サンプル 1 ～ 4 と比較して全体的な発現が低く、ばらつきが大きいことが示されていることに注意してください。それにもかかわらず、一意にマッピングされたシーケンスの割合が比較的高く、マッピングされていないシーケンスの割合が低いことが、現在のデータセットの品質を強調しています。

現在のデータセットの考察に戻ると、6 つの吸気性 preBötC ニューロンが CD-1 マウスで記録されました。 CD-1 マウスのスライスでは 1 つの Type-1 ニューロンしか識別できませんでした。 残りの 5 つは不明なタイプでした。 我々は、その膜特性に基づいて、タイプ 1 ニューロンが興奮性で律動性であることを比較的確信しています。 しかし、CD-1 野生型マウスの 5 つの未知ニューロンの伝達物質の種類や呼吸関連機能については確信が持てません。

4 つの Dbx1 preBötC ニューロンのうち、タイプ 1 は 3 つ検出されましたが、タイプ 2 は 1 つだけ検出されました。 単一の Type-2 トランスクリプトームに基づいて、Type-1 と Type-2 の Dbx1 preBötC ニューロン間の発現差について結論を導くことは困難です。 最小限のバッチ効果 (上記を参照) を考慮すると、Kallurkar らのレポートで以前に広められたトランスクリプトームを使用して、ここでタイプ 2 トランスクリプトームを分析できます 25。

図１〜図４において、 図6および7では、呼吸生理学者にとって共通の関心のある遺伝子の発現レベルを強調しています。 バーは、タイプ 1 (マゼンタ)、タイプ 2 (オレンジ)、および不明 (緑) を示すように色分けされています。 バーの高さは、各遺伝子の log2(FPKM) 発現レベルに対応します。 紫色のバーは、サンプル全体の平均値と SD を示します。 図６には、イオンチャネル型および代謝型シナプス受容体、神経ペプチド、神経ペプチド受容体、一過性受容体電位（すなわち、Ｔｒｐ）チャネル、およびリーリン（ｒｌｎ）が含まれる。 図 7 は、電位依存性イオン チャネル、調節サブユニット、および細胞内受容体を示しています。

イオンチャネル型および代謝型シナプス受容体、神経ペプチド、神経ペプチド受容体、一過性受容体電位 (すなわち、Trp) チャネル、およびリーリン (rln) の遺伝子発現レベル。 最初のバー (紫) は、すべてのサンプルの全体的な遺伝子発現レベルを表します (N = 10)。 右のバーは、NCBI GEO データベース (#GSE175643) のリスト順にニューロンの種類ごとにグループ化されています。サンプル 1 ～ 6 は CD-1 マウスからのものです。 サンプル 7 ～ 10 は Dbx1;Ai148 マウスのものです。 Type-1 ニューロン (ピンク) はサンプル 4 ～ 7 に対応します。 Type-2 ニューロン (オレンジ色) はサンプル 1 に対応します。 未知のニューロン (緑色) はサンプル 2、3、8 ～ 10 に対応します。 バーの高さは log2(平均 FPKM) 値を表します。 誤差バーは、すべてのサンプルにわたる標準偏差を示します (紫色のバーのみ)。

電位依存性イオンチャネル、調節サブユニット、細胞内受容体の遺伝子発現。 最初のバー (紫) は、すべてのサンプルの全体的な遺伝子発現レベルを表します (N = 10)。 右側のバーは、NCBI GEO データベース (#GSE175643) のリスト順に、ニューロンの種類ごとにグループ化されています。サンプル 1 ～ 6 は CD-1 マウスからのものです。 サンプル 7 ～ 10 は Dbx1;Ai148 マウスのものです。 Type-1 ニューロン (ピンク) はサンプル 4 ～ 7 に対応します。 Type-2 ニューロン (オレンジ色) はサンプル 1 に対応します。 未知のニューロン (緑色) はサンプル 2、3、8 ～ 10 に対応します。 バーの高さは log2(平均 FPKM) 値を表します。 誤差バーは、すべてのサンプルにわたる標準偏差を示します (紫色のバーのみ)。

ここで我々がトランスクリプトームを提示するニューロンは、Hayes らによって記載された Dbx1 由来ニューロンと非 Dbx1 由来ニューロンの同じ集団です 31。 しかし、その研究ではpreBötCニューロンは細胞内に記録されませんでした。 現在の preBötC ニューロン トランスクリプトームを Hayes らのトランスクリプトームと比較することができます。 後者のニューロンの生理学的表現型は特定されていないことに留意してください 31。

生のフラグメント数を処理するために作成されたカスタム R スクリプトは、無料で入手できます (https://github.com/prajkta9/bioinformatics-scRNA-seq)。

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NIH R01 HL104127 (PI: デル・ネグロ)、NIH R01 NS107296 (PI: デル・ネグロ)、NIH R01 AT01816 (PI: Conradi Smith および Del Negro)、NSF DMS 1951646 (PI: Conradi Smith)、NSF DEB 2031275 (PI) による資金提供：コンラディ・スミス）、NIH R15 HD096415（PI：サハ）。 著者らは、図 2 を作成するためのカスタム R スクリプトを支援してくれた Kyle T. David (ORCID ID: 0000-0001-9907-789X) に感謝します。

応用科学部、William & Mary、540 Landrum Drive、Williamsburg、Virginia、23185、USA

キャロライン・K・デヴィッド、プラジクタ・S・カルールカル、マリア・クリスティーナ・D・ピカード、グレゴリー・D・コンラディ・スミス、クリストファー・A・デル・ネグロ

東京慈恵会医科大学神経科学講座〒105-8461 東京都港区西新橋3-25-8

Yae K. Sugimura

生物学部、William & Mary、540 Landrum Drive、Williamsburg、Virginia、23185、USA

マーガレット・S・サハ

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Caroline K. David はデータを管理し、いくつかの図を設計および作成し、CADN を使用して原稿の一部を書きました。 Yae K.すぎむらは研究の構想を支援し、全細胞パッチクランプモードでpreBötCニューロンを記録し、ニューロンの特徴を調べ、増幅と配列決定のために細胞質内容物を収集し、原稿の編集を支援しました。 Prajkta S. Kallurkar は研究の発案を支援し、全細胞パッチクランプモードでの preBötC ニューロンの記録、増幅と配列決定のための細胞質内容物の収集、mm10 への配列の整列などのバイオインフォマティクスの実行、およびデータの分析を支援しました。原稿を書いて編集します。 Maria Cristina D. Picardo は、研究の着想を支援し、サンプルから cDNA ライブラリを調製し、配列決定のために cDNA ライブラリを送り、データを管理し、バイオインフォマティクスを支援し、原稿の執筆と編集を支援しました。 マーガレット S. サハは、研究の着想、実験プロトコルの設計と微調整、データの品質の評価、バッチ効果の分析、原稿の執筆と編集を支援しました。 Gregory D. Conradi Smith は、バイオインフォマティクス プロトコルの設計と微調整を支援し、ゲノムアライメントされたデータの品質を評価し、バッチ効果の分析を支援し、一部の図を作成し、原稿の一部を執筆および編集しました。 Christopher A. Del Negro は、この研究の構想を支援し、実験およびバイオインフォマティクスの取り組みを主導し、いくつかの図を作成し、CKD で原稿を書きました。

クリストファー・A・デル・ネグロへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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デビッド、CK、杉村、YK、Kallurkar、PS 他新生仔マウスのプレベッツィンガー複合体の吸気ニューロンの単一細胞トランスクリプトーム配列決定。 Sci Data 9, 457 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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受信日: 2022 年 3 月 10 日

受理日: 2022 年 7 月 19 日

公開日: 2022 年 7 月 30 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-022-01569-y

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