ヒトNK細胞NKRの構造

Nature Communications volume 13、記事番号: 5022 (2022) この記事を引用

3674 アクセス

3 引用

64 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヒト C 型レクチン様受容体であるナチュラルキラー (NK) 細胞阻害受容体 NKR-P1 によるシグナル伝達は、多くの免疫関連疾患やがんにおいて重要な役割を果たしています。 C タイプのレクチン様受容体は、そのリガンドに対して弱い親和性を持っています。したがって、細胞表面上の受容体の自然な状態を考慮したNKR-P1-LLT1相互作用の包括的なモデルを構築することが、その機能を理解するために必要である。今回我々は、NKR-P1およびNKR-P1:LLT1複合体の結晶構造を報告する。これは、NKR-P1が予想外の配置でホモ二量体を形成し、2つのLLT1分子を架橋する2つのモードでLLT1結合を可能にする証拠を提供する。これらの相互作用クラスターは、抑制性免疫シナプスを示唆しています。 SEC-SAXS分析を使用して溶液中でのこれらのクラスターの形成を観察し、細胞表面のdSTORM超解像度顕微鏡で観察し、新たに単離したNK細胞を用いて受容体シグナル伝達におけるそれらの役割を追跡することにより、両方のLLT1結合のライゲーションのみが存在することを示します。インターフェースは効果的なNKR-P1阻害シグナル伝達をもたらします。要約すると、我々の発見は集合的に、相互作用するタンパク質がリガンドと受容体の弱い親和性を克服し、免疫シナプスにおける細胞接触時にシグナル伝達を引き起こすことを可能にするNKR-P1:LLT1クラスター化のモデルを裏付けるものである。

ナチュラルキラー (NK) 細胞は、広範囲の活性化および抑制性の表面受容体を備えた自然免疫リンパ球であり、「欠損」および「自己誘導」メカニズムを通じて、悪性細胞、感染細胞、またはその他の形質転換細胞を敏感に認識して殺すことができます。抗体依存性細胞媒介性細胞傷害 (ADCC)1 による。さらに、NK 細胞は適応免疫応答の開始と発達にも寄与し、いくつかのクラスのサイトカイン、特に炎症促進性 IFN-γ1 を分泌します。興味深いことに、最近の研究結果では、NK 細胞が一種の免疫学的記憶さえ維持できることが示されており、NK 細胞が免疫において、特にその受容体を介して果たす主要な役割がさらに強調されています。

NK 受容体は、構造的に異なる 2 つのクラス、つまり免疫グロブリン様受容体ファミリーと C 型レクチン様受容体 (CTLR) のファミリーで構成されます 3,4。 CTLR はナチュラルキラー遺伝子複合体 (NKC、ヒト 12 番染色体) 内にコードされており、C 型レクチンとは異なり、CTLR はカルシウムイオンに結合せず、炭水化物リガンドとも結合しません 5,6。代わりに、CTLR はタンパク質リガンドと相互作用することが知られています。たとえば、Ly49、CD94/NKG2、NKG2D などの受容体は MHC クラス I 様分子を認識します 3。一方、NKR-P1 サブファミリーの受容体は構造的に関連性の高い Clr/Ocil CTLR を認識します。これらは、NKR-P1 をコードする KLR 遺伝子と遺伝的に密接に関係している CLEC2 遺伝子 3,5 によってコードされています。このユニークな CTLR:CTLR 相互作用システムは、非 MHC 欠落自己認識と誘導自己認識の両方に関与しています 3,4,5。いくつかの阻害性および活性化性のNKR-P1受容体がマウスおよびラットで報告されている。しかし、ヒト受容体 NKR-P1 (CD161、KLRB1 遺伝子) は 1994 年以来、これまでに記載されている唯一のヒトオルソログであり続けています 7。それにもかかわらず、NKR-P1 との構造的および機能的相同性に基づいて、ヒト活性化 CTLR:リガンドペア NKp65:KACL (KLRF2:CLEC2A)8 および NKp80:AICL (KLRF1:CLEC2B)9 が、ヒト NKR-P1 の活性化対応物として提案されています。 P14、10。

ヒト NKR-P1 (CD161) は、NK 細胞のマーカーとして初めて報告され 7、NKR-P1 は、IL-1213 によって上方制御される抑制性受容体として機能します 7、11、12。しかし、NKR-P1 はナチュラルキラー T (NKT) 細胞 14、粘膜関連インバリアント T (MAIT) 細胞 15、および T リンパ球の他のサブセット 16 によっても発現され、NKR-P1 は共刺激受容体として作用し、IFN- γ分泌11,17。当然のことながら、NKR-P1 は未熟な CD16- CD56- NK 細胞 18 や、臍帯血中の Th17 細胞および MAIT 細胞の前駆体 19 でも検出されます。最近、NKR-P1 が神経膠腫浸潤 T 細胞で同定され、T 細胞を介した神経膠腫細胞の死滅において阻害的、免疫抑制的な役割を果たしていることが判明しました 20。さらに、NKR-P1 は、内因性リガンドであるレクチン様転写物 1 (LLT1) との相互作用により、免疫学的に特権的なニッチへの経内皮遊走を促進します 19,21,22。

LLT1 (遺伝子 CLEC2D) は、主に活性化された単球および B 細胞で発現されます 23。これらの細胞では、LLT1 が NK 細胞の自己寛容の維持に役立ちます 10,23。ただし、IL-2 は NK 細胞および T 細胞での発現を誘導できます 24。さらに、LLT1 は神経膠芽腫 25、前立腺がんおよびトリプルネガティブ乳がん 26,27、B 細胞非ホジキンリンパ腫 28 細胞で上方制御されており、LLT1 は NK 細胞の細胞毒性を弱めることで免疫回避に寄与しています。興味深いことに、神経膠腫腫瘍では CD161+ Th17 細胞の数の増加が検出されています 29。同時に、IL-17 産生制御性 T 細胞 30、Tc17 細胞のサブセット 31、およびすべての Th17 細胞 19 上の NKR-P1 受容体の機能は、これらの細胞がいくつかの自己免疫疾患 (クローン病 32、多発性硬化症 33、関節リウマチ34、乾癬35)。したがって、NKR-P1 受容体と LLT1 などのリガンドの分析は、免疫系の生理学的プロセスと病原性プロセスの両方の根底にある構造と機能の関係についてのより深い洞察を得るために不可欠です。

ヒト NKR-P1 および LLT1 は、同様のタンパク質トポロジー 4 を持つ II 型膜貫通糖タンパク質です。N 末端の細胞質シグナル伝達テール、膜貫通ヘリックス、柔軟なストーク領域、C 末端の C 型レクチン様ドメイン (CTLD) 3 です。 7,36。さらに、NKR-P1 と LLT1 は両方とも、おそらくそれらのストーク領域で結合しているジスルフィドホモ二量体を形成することが示されました 7,36。しかし、NKp65:KACL 複合体 37 の構造は、ヒト C 型レクチン様 (CTL) 受容体:リガンドサブファミリーのすべての複合体の中で、これまでに解明されている唯一のものです。その後の研究では、NKp65 と KACL 間の相互作用はタンパク質に基づいており、グリコシル化とは独立していることがさらに示されました 38。これらのデータに基づいて、NKR-P1:LLT1 複合体のモデルがその後提案され、NKR-P1 および LLT1 変異体の表面プラズモン共鳴 (SPR) 分析を通じて重要な相互作用残基が同定され、この相互作用の高速動態が強調されました 39,40 。さらに、マウスサイトメガロウイルス（MCMV）イムノエバシンタンパク質m12またはその同族リガンドClrbと複合体を形成した関連マウスNKR-P1B外部ドメインの構造が最近報告されている41,42。以前、我々は、グリコシル化 44 に関係なく、CD6945、46、および Clrg47 で観察された CLEC2 にコードされたリガンドの保存された二量体化モードに従って、非共有結合性二量体を形成する LLT143 の最初の構造を報告しました。それにもかかわらず、細胞表面で発現されたときのこれらのタンパク質の自然な状態に対応する、CTLR:リガンド複合体の二量体:二量体相互作用の包括的なモデルはまだ利用可能ではない。

ここでは、ヒト NKR-P1 の構造を調査し、LLT1 結合に対する NKR-P1 二量体化の影響を調べます。我々は、LLT1と複合体を形成したNKR-P1の結晶構造を示し、以前の溶液中相互作用観察を説明し、LLT1上の2つの異なる非対称結合部位を利用したこの複合体の新規アセンブリを示す。我々の結果は、ヒトNKR-P1受容体がリガンド結合による架橋とクラスター化によってLLT1に対する弱い親和性をどのように克服するかを説明し、NK細胞免疫シナプス内でのこの受容体のシグナル伝達様式を解明し、それによって、NKR-P1受容体の優れたモデルを提供するものである。関連する相同低親和性複合体の今後の説明。

ヒト NKR-P1 外部ドメインの 2 つの結晶構造が解明されました。均一な Asn-GlcNAc2Man5 N-グリカンを有するグリコシル化された NKR-P1 (NKR-P1_glyco) の構造と、最初の GlcNAc 残基の後に N-グリカンが切断された脱グリコシル化された NKR-P1 の構造です。 (NKR-P1_デジグリコ); すべての構造に関する統計データの概要を表 1 に示します。両方の結晶構造の NKR-P1 は、CTL ドメインの一般的な折り畳み特性、つまり 2 つの α ヘリックス (α1 および α2) と内部に保存された疎水性 WIGL モチーフを持つ 2 つの逆平行 β シートに従います。ドメインコア (図 1 および 2a)。 2 つの β シートは、それぞれ β0、β1、β1'、β5 と β2、β2'、β3、β4 によって形成されます (Zelensky と Gready5 による割り当て。他の関連する CTL 構造を記述するためにも使用されます 37,40) ）。さらに、3 つの分子内ジスルフィド結合 (Cys94-Cys105、Cys122-Cys210、および Cys189-Cys202) がドメインを安定化します。

二次構造要素およびループ領域 (L) は、アラインメントの上の NKR-P1 および LLT1 について示されています。下部のペアの数字は、NKR-P1 および LLT1 構造のジスルフィドペアを示します。アスタリスクは、LLT1 の His176Cys 変異および NKR-P1 の Ile168 残基を示します。 NKR-P1 および LLT1 の予測される N-グリコシル化部位は、オレンジ色の三角形で示されています。保存された WIGL モチーフには黒の下線が引かれています。配列の上の青い線は、NKR-P1 または LLT1 の非共有結合二量体を形成する領域を示します。保存された残基は赤色でマークされます。太字は厳密に保存された残基を示します。 a ヒトNKR-P1関連NK細胞受容体、すなわちヒトNKR-P1、NKp65、およびNKp80のCTLDの配列アラインメント。一次結合モードでNKR-P1:LLT1複合体でLLT1と接触するNKR-P1残基、およびNKp65:KACL複合体でKACLと接触するNKp65残基は緑色で強調表示されます。紫色の三角形は、二次結合モードで NKR-P1:LLT1 複合体の LLT1 と結合する NKR-P1 残基を示します。 b LLT1関連ヒトCLEC2リガンド、すなわちLLT1、KACL、およびAICLのCTLDの配列アラインメント。一次結合モードでNKR-P1:LLT1複合体でNKR-P1と接触するLLT1残基、およびNKp65:KACL複合体でNKp65と接触するKACL残基は緑色で強調表示されます。紫色の三角形は、二次結合モードで NKR-P1:LLT1 複合体内の NKR-P1 に結合する LLT1 残基を示します。アライメントはClustal Omega83で実行され、グラフィックスはESPript 3.084で作成されました。

NKR-P1 CTLD のリボン図。二次構造要素は異なる色でラベル付けされています。ヘリックス α1 は赤、ヘリックス α2 は黄色、β ストランドとループはシアンです。 b NKR-P1のグリコシル化（シアン）、脱グリコシル化遊離（緑）、およびLLT1結合（青）形態によって形成されるNKR-P1二量体の間の比較。 c マウスデクチン-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb、マゼンタ) とヒト LLT1 (https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb) のヘリックス α1 および α2 中心二量体化の比較、緑）それぞれ。ヘリックスα1とα2は赤と黄色で示されています。各二量体から 1 つの単量体のみを整列させることによって調製された、デクチン-1 および NKR-P1 ホモ二量体、ならびに LLT1 および NKR-P1 ホモ二量体の構造整列を右側に示します。 CTLD フォールドは整列したモノマーの各ペアで保存されていますが、ヘリックス α1 を中心とするダイマーとヘリックス α2 を中心とするダイマーは逆の配置を示します。

NKR-P1_glyco の非対称ユニットには 2 つのモノマーが含まれていますが、NKR-P1_deglyco の非対称ユニットには 8 つの NKR-P1 モノマーが含まれています。これらすべてのモノマーは非常に類似したホモダイマーに配置されており、Cα原子上のペアワイズRMSDは最大0.5Åです（図2b）。しかし、これらのホモ二量体は予想外の構成を持っています。つまり、二量体化界面にヘリックスα2を持つCD69やLLT1などのCLEC2リガンドのCTLDで観察される通常の二量体化モードに従いません。代わりに、NKR-P1 の二量体化界面は、マウス C 型レクチン様パターン認識受容体デクチン-1 (https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb)48 と同様に、ヘリックス α1 によって形成されます。ヒトNKR-P1はCTLDと32％の配列同一性しか共有しません（図2c）。 NKR-P1 とデクチン-1 二量体の間の Cα 原子の RMSD は、重複領域で 3.7 Å です (NKR-P1 二量体の合計 250 残基のうちの 196 個と一致します)。構造的に異なる領域は主にヘリックスα2をカバーしており、その位置はNKR-P1とデクチン-1の間で最大7Å異なります。また、ラット NKR-P1B 受容体細胞外ドメイン (https://doi.org/10.2210/pdb5J2S/pdb)49 の 1.4 Å RMSD の共有結合ジスルフィド二量体の構造において、ヘリックス α1 中心二量体化界面との非常に類似した配置が観察されました。これら 2 つの二量体間の Cα 原子（補足図 1a）。反対に、マウスNKR-P1Bの非古典的二量体（https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb）42は、全体の配置がまったく異なります（補足図2a）。

NKR-P1ホモ二量体の二量体化界面は、6つのタンパク質間水素結合といくつかの水媒介水素結合（補足表1）、非局在化電子（Lys126-Glu127）を介したペプチド結合相互作用、およびLeu119、Ala120を含む小さな疎水性コアで構成されています。、および両方の鎖からの Ile168 (図 3)。接触表面積は約 100 μm です。 500Å2。ヘリックスα2中心のLLT1二量体（7～12の水素結合、より強力な疎水性コア、500～800Å2の接触表面積）43と比較して、ヘリックスα1中心のNKR-P1二量体は、より少ない接触残基でより小さな接触表面積を介して形成されます。。

a Dimerization interface of human NKR-P1. Subunits of human NKR-P1 are shown as Cα-trace (blue and cyan), and the dimer contact residues are shown as sticks with carbon atoms colored in light blue (blue subunit) and orange (cyan subunit); for clarity, only the residues of the blue subunit are labeled. The first GlcNAc unit N-linked to Asn116 and the carbohydrate chain N-linked to Asn169, observable in the NKR-P1_glyco structure, are shown with carbon atoms colored yellow and green, respectively. b Top view of the dimerization interface. The NKR-P1 subunits surfaces are colored blue and cyan. The GlcNAc units bound to Asn116 are shown as sticks with carbon atoms in yellow. Contact residues between the GlcNAc bound to chain A, and the chain B, are shown in yellow, whereas contact residues between the GlcNAc bound to chain B, and the chain A, are shown in purple. Hydrogen bonds are shown as green-dashed lines with a detailed view on the right-hand side. c Mixed glycosylation states at the dimer interface in the NKR-P1_deglyco structure. The GlcNAc unit N-linked to Asn157 of chain A is modeled with an occupancy of 0.5, while the second GlcNAc unit present at Asn116 of chain B is not modeled. Contours of 2mFo-DFc (2.8σ, cyan) and mFo-DFc (1σ, green) electron density maps are shown. d Small hydrophobic core in the central part of the NKR-P1 dimerization interface (subunits colored as in (a)). The central residues are shown as spheres with carbon atoms in yellow. The carbon atoms of Ile168 residues (whose mutation decreases the ability of NKR-P1 to bind LLT1)C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e2666">51 はオレンジ色で表示されます。

NKR-P1外部ドメインには、残基Asn116、Asn157、およびAsn169に3つの潜在的なN-グリコシル化部位が含まれています（図1a）。 Asn169 でのグリコシル化は、NKR-P1_glyco 構造と _deglyco 構造の両方の電子密度マップで確認できます。 NKR-P1_glycoでは、完全なGlcNAc2Man5炭水化物鎖が鎖Aに局在しているのに対し、部分的なGlcNAc2Man3鎖は鎖Bに局在しています（図3a）。 NKR-P1_deglyco では、8 つの NKR-P1 鎖すべてで Asn169 に残っている単一の GlcNAc ユニットを明確に同定できます。興味深いことに、NKR-P1_glyco の Asn116 に結合した局所的な最初の GlcNAc ユニットと、NKR-P1_deglyco に残っている Asn116 および Asn157 の重複する GlcNAc ユニットは、ヘリックス α1 の残基および反対側のサブユニットの領域 β2、L1、および β2' との二量体化接触に関与しています。 NKR-P1ホモ二量体の構造（図3b）。 NKR-P1_glyco では、Asn116:GlcNAc と反対側のサブユニット間の 5 つの水素結合により、ヘリックス α1 中心のホモ二量体が安定化されます (補足表 1)。 NKR-P1 の反対側の鎖と局在化 GlcNAc ユニットの間の接触表面積は約 125 Å2 です。

NKR-P1_deglycoでは、ホモ二量体界面の密度は、NKR-P1二量体の一方の鎖のAsn116または反対側の鎖のAsn157のいずれかの残りのGlcNAcユニットを収容できます（詳細については、方法、表1および図3cを参照）。逆に、NKR-P1_glyco では、Asn116 の最初の GlcNAc ユニットは、NKR-P1 二量体の両方の鎖 A および B の電子密度で明確に定義されていますが、Asn157 でのグリコシル化の電子密度は見つかりませんでした。これは、Asn116 または Asn157 のいずれかのグリコシル化が二量体形成に寄与する可能性があるものの、両方の N-グリカンが同時に存在すると立体障害によって二量体化が損なわれる可能性があることを示唆しています。この仮説を検証するために、NKR-P1 S159A 変異体を発現させ、Asn157 のグリコシル化を無効にしました。 CD分光法で評価すると、変異体の全体的な折り畳みは野生型NKR-P1に匹敵します（補足図3a）。実際、分析用超遠心分離によって分析すると、変異タンパク質はかなりのレベルのオリゴマー種を示しました（補足図3b）が、野生型NKR-P1外部ドメインは純粋に単量体です50。したがって、グリコシル化の不均一性は、ヒト NKR-P1 の二量体化の傾向、したがって LLT1 と多量体複合体を形成する能力に影響を与える可能性があります。

NKR-P1:LLT1 複合体の結晶構造は、脱グリコシル化された NKR-P1 および LLT1 外部ドメインによって形成されます。結晶の非対称ユニットには、二量体NKR-P1と二量体LLT1および追加のNKR-P1二量体との複合体が含まれています（図4a）。これらのNKR-P1二量体は、上記の非結合NKR-P1二量体の構造と同じヘリックスα1中心の二量体化界面を持っています（図2b）。 LLT1 二量体は、非結合 LLT1 構造で以前に説明されたものと同じ、予想されるヘリックス α2 中心二量体化モード (図 2c) を保持しています 43。 LLT1 は、残基 Asn95 および Asn147 に明確に識別可能な GlcNAc ユニットを持っています。複合体の電子密度で観察された NKR-P1 グリコシル化は、NKR-P1_deglyco 構造で特定されたグリコシル化と一致します。

a 複雑な結晶構造の全体的な構成。 LLT1 ダイマー (緑/レモン) は、青とシアンのモノマーによって形成される NKR-P1 ダイマーと接触します。 2 番目の青シアン NKR-P1 二量体は、結晶対称性によって最初の二量体と関連しています。シアンの NKR-P1 モノマーは一次相互作用モードで LLT1 と相互作用しますが、青色の NKR-P1 モノマーは二次相互作用インターフェースを使用して LLT1 と結合します。黒いアスタリスクは、プライマリモードとセカンダリモードでバインドされた NKR-P1 の相互アクセサリ接触を示します。さらに、結晶の非対称ユニットには、LLT1 との接触を欠いた別の NKR-P1 二量体 (ピンク/マゼンタ) が含まれています。 b 2つのNKp65モノマー（赤; https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb）と複合体を形成した二量体KACL（紫）の構造と、その2つを組み合わせたLLT1二量体（緑/レモン）の構造の全体的な比較。 NKR-P1 分子は、一次結合モード (シアン、左側) および二次結合モード (青色、右側) で相互作用します。一次または二次 NKR-P1:LLT1 相互作用モードのみとの比較が下のセクションで強調表示されています (どちらも側面図、90° y 軸回転を使用)。 c、d NKR-P1:LLT1 のプライマリおよびセカンダリ相互作用インターフェイス。 5 Å 以内の接触残留物は黄色で表示されます。 4 つの最も強い接触を形成するアミノ酸は、一次モードでは赤色で、二次モードではマゼンタで強調表示されます。

LLT1ホモ二量体はそのパートナーと二価で結合します。つまり、1つの二量体は結晶学的対称性によって関連する2つのNKR-P1二量体と相互作用します。各LLT1単量体は別個のNKR-P1ホモ二量体の異なるサブユニットに結合します（図4a）。結合パートナーの明らかな誘導適合はありません。相互作用しない NKR-P1 二量体と相互作用する NKR-P1 二量体 (NKR-P1_glyco および複合体) の間の Cα 原子の RMSD は 0.5 Å であり、LLT1 の RMSD は 0.5 Å です (https://doi .org/10.2210/pdb4QKI/pdb および現在の複合体）は 0.7 Å です。さらに、N 結合グリコシル化鎖は相互作用に直接寄与しません。

NKR-P1 と LLT1 は、この構造において 2 種類の接触を確立します。つまり、一次相互作用モード (LLT1 チェーン B:NKR-P1 チェーン D) と二次相互作用モード (LLT1 チェーン A:NKR-P1 対称関連チェーン C) です。一次相互作用モードは、相同なヒト NKp65:KACL 複合体の構造 (https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb)37 とよく一致します。2 つの複合体の Cα 原子の RMSD は 1.3 Å (それぞれの場合、受容体とリガンドの 1 本の鎖、図 4b、左下）。同様に、MCMV immunoevasin m12 と複合体を形成したマウス NKR-P1B の構造では、観察された相互作用界面はヒト NKR-P1 複合体の現在の構造の一次モードと一致しますが、m12 タンパク質によってカバーされる領域はかなり大きいです (補足図) .1b、c)41。最近記載されたマウスNKR-P1B:Clrb複合体の構造(https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb)42も、両方のNKR-P1受容体に共通する相互作用界面を示した(補足図2b、c)。ただし、NKR-P1：LLT1複合体の2番目の相互作用モードで観察される受容体：リガンドの配置は独特であり、リガンドの方向において既知のすべての相同複合体とは異なります（図4b、右下、および補足図2b）。

一次相互作用モードと二次相互作用モードの両方に関与するヒト NKR-P1 の相互作用インターフェースは非常に似ています。それらは主にL0、L3、L5、およびL6ループの膜遠位残基とβ3およびβ4鎖によって形成され（図4c、d）、LLT1との相互作用のための平坦な表面を作成します。対照的に、LLT1 では、一次相互作用界面と二次相互作用界面は、少数の残基を共有しているにもかかわらず、実質的に異なります。ループL0'、L0、L3、L5、L6、およびストランドβ3およびβ4はLLT1の一次相互作用パッチを形成しますが（図4c）、ループL2およびL5の残基、ストランドβ2''およびヘリックスα2は、 2番目の相互作用界面（図4d）どちらの相互作用モードでも、受容体の膜近位部分とリガンドが複合体の反対側に配置され、2つの隣接する細胞間の相互作用の妥当なモデルが作成されます。

一次相互作用モードは、2 つの電荷サポート相互作用と π-π スタッキング (Tyr201-Arg175) 相互作用に加えて、9 つの直接水素結合といくつかの水媒介水素結合によって確立され、総接触表面積は約 100 です。 800 Å2 (補足表 1)。 4つの最も強い結合は、NKR-P1残基Arg181、Tyr201、Lys148、およびSer199と、LLT1残基Glu179、Glu162、Ser129、およびTyr177の間にそれぞれ発生します（図4c）。 2 番目の相互作用モードは、5 つの直接水素結合、2 つの電荷サポート相互作用および疎水性 (LLT1:Pro156 – NKR-P1:Ala149、Leu151) 相互作用によって確立され、総接触表面積は約 100 です。 550 Å2 (補足表 1)。 3つの最も強い結合は、NKR-P1残基Asp147、Ser199、およびArg181と、LLT1残基Arg153、Lys169、およびAsn120の間にそれぞれ発生します（図4d）。

LLT1 との相互作用に加えて、一次および二次モードで結合した NKR-P1 二量体は、無視できない相互アクセサリー接触も持っています (対称関連位置の NKR-P1 鎖 D および NKR-P1 鎖 C、Csym)。界面面積は 440 Å2 で、7 つの直接水素結合によって確立されます (補足表 1)。 4 つの残基が界面の上にそびえ立っています: D 鎖の Asn143 と Arg146、および Csym 鎖の Asn174 と Asn176 (どのアスパラギン残基もグリコシル化部位ではありません)。この界面には、水を介した接触もいくつかあります。

溶液中のNKR-P1:LLT1複合体のサイズと形状を特徴付けるために、分析用超遠心分離（AUC）、マイクロスケール熱泳動（MST）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC-SAXS）と組み合わせた小角X線散乱を実行しました。）実験。取得された AUC データは濃度に依存しており、SEC-SAXS 測定の結果と同様に、この相互作用システムの動的な性質を反映しています。遊離ヒト NKR-P1 外部ドメインは単量体であり、沈降係数 s20,w は 2.1 S で、推定分子量 18 kDa に相当し、予想値 17.5 kDa とよく一致します。 LLT1 細胞外ドメインは、以前に特徴づけられたように、非常に低濃度を除いて単量体に解離しない安定な非共有結合二量体 (2.9 S) を形成します 43,50。 NKR-P1:LLT1等モル混合物の添加濃度を増加させると、複合体の沈降係数も増加し、最高分析濃度でs20,w値3.7 Sに達します(補足図3c)。この値は、使用した高タンパク質負荷濃度 (18 mg/ml) によって引き起こされる非理想性を補正すると、タンパク質濃度ゼロの推定沈降係数 s020,w 値 4.5 S、および中程度に伸長した粒子に相当します。寸法は 10 ～ 15 × 4 ～ 5 × 4 ～ 5 nm。これは、複合体の結晶構造で観察される可能性のあるNKR-P1:LLT1相互作用集合体、すなわちモノマー:ダイマー:モノマーまたはダイマー:ダイマーで予想される8〜10×5〜6×4〜5nmの寸法とよく比較します( N-グリカン鎖は脱グリコシル化された複合体の構造には存在しませんが、溶液中でのすべての分析中に存在しました)。

結晶構造内で観察される二次相互作用モードが溶液内でも利用されるかどうかを理解するために、LLT1のN120R、R153E、K169A三重変異体（LLT1SIM）を設計し、LLT1二次相互作用界面の3つの最も強い接触を廃止しました（図1）。 4d）。 LLT1SIM 変異体は、野生型 LLT1 と同じ方法で発現および精製され、同等の CD スペクトルを示しました（補足図 3a）。 NKR-P1:LLT1SIM 等モル混合物濃度シリーズは s20,w 値 3.3 S (推定 s020,w 値 3.9 S に相当) に達し、野生型 NKR と比較してより小さいサイズの複合体の形成を明らかに示しています。 -P1：LLT1混合物、おそらくモノマー：ダイマーアセンブリ（補足図3d）。連続サイズ分布 c(s) 曲線全体を統合し、使用した LLT1 タンパク質の濃度に対して結果として得られた重量平均 S 値をプロットすることにより、両方の希釈系列について結合等温線が構築され、まず最も単純なヘテロ会合結合モデルに最適に適合しました。 A + B ⇔ AB、ここで、AはLLT1二量体、BはNKR-P1単量体です（補足図4a）。 LLT1SIMは、野生型LLT1よりも約3倍弱い全体的な親和性を示しました。これは、LLT1またはLLT1SIMで滴定された蛍光標識されたNKR-P1を使用した独立したMST分析によってさらに裏付けられました（補足図4b）。 2番目のNKR-P1モノマーの結合に関する野生型LLT1とLLT1SIMの違いを分析するために、A + B ⇔ AB + B ⇔ BABモデルを使用してデータを最適化しました（補足図4c）。野生型 LLT1 の場合、これにより適合度が向上し、おそらく一次相互作用モードと二次相互作用モードに対応する 2 つの異なる KD 値が得られましたが、LLT1SIM では、適合した KD 値は変化せず、2 番目の NKR-P1 モノマーの結合が反証されました。同様に、AUC および MST データが、以前に最適化された値に固定された AUC パラメーターとともにグローバルに近似された場合、LLT1SIM MST データは、AB モデルと BAB モデルの両方に同様に良好に近似できました。対照的に、野生型LLT1の場合、ABモデルの適合は不十分です（補足図4d）。まとめると、我々のデータは、二次相互作用界面が単なる結晶接触ではなく、NKR-P1:LLT1 相互作用の全体的な親和性に大きく寄与していることを示しています。

この相互作用の速い反応速度、実験の長い時間スケール、およびタンパク質濃度が沈降境界に沿って着実に減少するという事実を考慮すると、AUC 沈降速度実験ではさらに高次の集合体を観察する可能性は低いです。しかし、NKR-P1:LLT1複合体の結晶構造は、受容体:リガンド二量体の鎖状配置を示唆しています。このような集合体が溶液中に存在するかどうかを確認するために、15 mg/ml の負荷濃度で NKR-P1:LLT1 等モル混合物の SEC-SAXS 分析を実行しました。 SEC-SAXS 実験では、2 つの異なる SAXS ピークに対応する 280 nm での 2 つの吸光度ピークが観察されました (図 5)。さらなる分析のために、最初のピークから 4 つのデータ間隔と 2 番目のピークから 2 つのデータ間隔をサンプリングし、これらの間隔内のデータを個別に結合しました (図 5 および補足図 5)。 SAXS 信号から計算された回転半径は、保持体積に応じて着実に減少します。メインピークの 2 つの小さなプラトーは、複合体の形成と解離の間の動的なバランスを示唆しています (図 5)。その結果、統合された散乱曲線は、NKR-P1:LLT1 複合体の単一構造またはその成分からシミュレートされた散乱曲線にうまく適合できませんでした。したがって、我々は、一次相互作用モードのみ、二次相互作用モードのみ、または両方の相互作用モードを交互に使用して、分子の順序のすべての可能な順列を考慮して、さまざまな長さ（タンパク質鎖の数）のNKR-P1:LLT1複合体の集合体のモデルを構築しました。。次に、これらすべてのモデルの結果として得られたライブラリ（合計 49 の異なる構造）を OLIGOMER ソフトウェアで使用して、サンプリングされたデータ間隔（補足図 5）および個々の SAXS 実験曲線（補足データ 1）を最適化しました。このアプローチにより、サンプリングされた SAXS データは、より高い化学量論比 (χ2 1.29–3.47; 完全なグリコシル化はモデル化されていないが、散乱に寄与していることに注意) の NKR-P1:LLT1 複合構造のグループの重ね合わせ計算散乱曲線にかなりよく適合します。 ; 補足図5)。 SAXS データから計算された回転半径が連続的に減少することに続いて、NKR-P1:LLT1 複合体の最適構造の化学量論も保持体積とともに絶えず減少します。最初のピークの SAXS 散乱曲線は、鎖状オリゴマー内で 2 〜 3 個の NKR-P1 ダイマーと相互作用する 2 〜 3 個の LLT1 ダイマーに最もよく適合し、2 番目のピークの曲線は 1 個の NKR-P1 と相互作用する 1 個の LLT1 ダイマーに最適です。一次モードまたは二次モードのダイマー。特に、OLIGOMER は一般に、一次モードまたは二次モードのみのモデルに対して、一次相互作用モードと二次相互作用モードを組み合わせたアセンブリを好んでいました。

15 mg/ml 負荷濃度での NKR-P1:LLT1 等モル混合物のサイズ排除クロマトグラフィープロファイル (黒線) と SAXS 散乱シグナル (赤線) の重ね合わせ。どちらの信号も 2 つの異なるピークを示します。収集された各 SAXS フレームについて、AUTORG を使用して回転半径が計算されました (青い円)。さらなる分析のために、SAXS データの 6 つの間隔が選択され、個別にマージされました (フレーム 355 ～ 367、368 ～ 378、379 ～ 388、389 ～ 399、431 ～ 440、481 ～ 491。斜めのハッチングの列として示されています)。マージされたデータのデータ品質評価のために、区間 389 ～ 399 および 481 ～ 491 の SAXS 散乱曲線 (a)、クラッキープロット (b)、およびペア距離分布関数 (c) が挿入図に示されています。次に、6 つのマージされたデータ間隔すべてが OLIGOMER によって個別に分析されました (補足データ 1 および補足図 5)。 SEC-SAXS 実験からの回折データが寄託されています (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j3.1)81。

生細胞の状況におけるこれらの高次複合体の生物学的関連性に答えるために、我々はNKR-P1発現細胞株を用いて単一分子局在顕微鏡研究を実施し、LLT1またはLLT1に関してNKR-P1の表面分布を定量した。 LLT1SIM バインディング。 piggyBac システムを使用して生成された全長 NKR-P1 トランスフェクタントは、単一分子局在顕微鏡検査を可能にするために、限られた密度で受容体を発現するように誘導されました。次に、細胞を可溶性 LLT1 または LL1SIM の存在下または非存在下でインキュベートし、固定し、抗 NKR-P1 AlexaFluor® 647 mAb で標識しました。直接確率的光学再構成顕微鏡法（dSTORM）画像を取得し、ボロノイテッセレーションクラスター分析を使用して、細胞表面上のNKR-P1のナノスケール組織に対する可溶性LLT1の影響を評価しました（図6a）。 LLT1 が存在しない場合、平均面積 1870 ± 777 nm2 (図 6b) および平均直径 41 ± 7 nm (図 6c) の蛍光イベントのクラスターが検出されました。 10〜40 nm（図6d）、AlexaFluor® 647二重標識NKR-P1ホモ二量体を示します（各mAbあたり約6 nm + 10 nmのリンクエラー、局在化精度±15 nm。蛍光クラスターの見かけのサイズに注意してください）受容体クラスターのサイズには直接対応しません）。可溶性LLT1の添加により、観察されたイベントのクラスターの直径（47±6 nm; p < 0.0001、図6c、d）、面積（2713 ± 1180 nm2; p < 0.0001、図6b）、およびクラスター内で検出されたイベントの数（38.8±12.3; p < 0.0001、図6e）、一方、クラスター内のイベントの密度は予想どおり変化しませんでした（図6f）。さらに、NKR-P1 ナノスケール組織に対する LLT1SIM 添加の効果は、陰性対照と統計的に区別できませんでしたが、LLT1 添加の効果とは大きく異なりました。これら 3 つの異なる受容体状態 (遊離、LLT1 結合、LLT1SIM 結合) の相対比較に基づいて、相互作用時にナノスケールの NKR-P1 クラスターを形成するには、LLT1 の二次相互作用界面が必要であると推測できます。細胞内部表面（評価領域）あたりのイベントの総密度に有意差は見られず（図6g）、測定全体を通じてNKR-P1の発現レベルが安定していることを示しています。その結果、NKR-P1 ナノクラスターのサイズは、NKR-P1 発現レベルの違いによるものではなく、LLT1 が 2 つ以上の NKR-P1 ホモ二量体を架橋するために（1 つのホモ二量体単位を超えて）増加します。

NKR-P1 安定トランスフェクタントを可溶性 LLT1 または LLT1SIM の存在下または非存在下でインキュベートし、NKR-P1 の細胞表面分布を超解像度顕微鏡でモニタリングしました。 a LLT1 (赤) または LLT1SIM (緑) なし (黒) または LLT1 SIM (緑) なしでインキュベートし、AlexaFluor® 647 標識で固定および染色した、PLL コーティングされたスライド上の全長 NKR-P1 HEK293 安定トランスフェクタントの代表的な明視野 (BF) および dSTORM 画像抗NKR-P1モノクローナル抗体; スケールバーは 5 μm を表します。 10 µm2 の領域 (dSTORM 画像の赤いボックス) が拡大され、蛍光イベント (CoE) マップとバイナリマップの対応するクラスターが表示されます。スケールバーは 1 μm を表します。 b–g LLT1またはLLT1SIM可溶性リガンドの存在によって誘発される全長NKR-P1分布の相対的変化の分析：イベントのクラスターの平均面積（b）、イベントのクラスターの平均直径（c）、イベントのクラスターのサイズ分布ポアソン分布関数を重ねた直径 (d)、イベントのクラスターごとの平均イベント (e)、イベントのクラスターごとに検出されたイベントの密度 (f)、および検出されたイベントの総密度 (g)。 b、c および e、f では、各プロット点は、単一細胞の全内面の分析から得られた平均値を表します。箱ひげ図の中心は全体の平均値を表し、箱の境界は四分位範囲を表し、ひげは±SDを表します。データは、それぞれ 7 回または 4 回の独立した実験で n = 45 個の NKR-P1+ 対照細胞、および LLT1 または LLT1SIM とインキュベートした n = 41 または n = 47 個の NKR-P1+ 細胞からのものです。ボンフェローニ補正を使用した一元配置分散分析、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001、ns。重要ではありません。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、NK細胞媒介細胞毒性アッセイで、新たに単離したNK細胞の表面に発現した天然NKR-P1の阻害能に対する可溶性LLT1またはLLT1SIMの影響を分析し、NKR-P1リガンド結合誘導性の影響をさらに調査しました。細胞シグナル伝達における架橋。 3 人の異なる健康なドナーの血液から単離した NK 細胞を IL-2 で活性化し、エフェクター：標的細胞比 40:1 で K562 標的細胞と混合し、ネガティブコントロールとして PBS 緩衝液または可溶性緩衝液と 4 時間インキュベートしました。 LLT1 または LLT1SIM (両方とも 2 つの異なる濃度)。 NKR-P1 リガンドの非存在下では、K562 細胞は NK 細胞媒介溶解に対して十分に感受性です (図 7; PBS コントロール、生きた K562 細胞は 10% 未満)。予想通り、可溶性 LLT1 の存在下では溶解は実質的にブロックされました。対照的に、変異した二次相互作用インターフェースを持つ LLT1SIM バリアントは、NK 細胞媒介の細胞毒性をブロックできませんでした。細胞表面上の dSTORM によって観察されたように (図 6)、LLT1SIM は NKR-P1 を効率的に架橋しません。この変異体は、NKR-P1 阻害性受容体経路を介してシグナル伝達することもできません。したがって、顕微鏡と細胞毒性アッセイの両方のデータに基づいて、LLT1ライゲーションによって引き起こされるNKR-P1架橋は生物学的に関連しており、細胞シグナル伝達に不可欠であり、一次相互作用モードと二次相互作用モードの両方での相互作用が必要であると結論付けます。

3 人の異なるドナー (青、赤、緑) からの NK 細胞と K562 標的細胞を、PBS 緩衝液のみ (陰性対照)、または 1 倍および一次相互作用モードの AUC によって分析された、それぞれ 5× KD 値 (補足図 4 を参照)。棒グラフは各条件における生存K562細胞の平均を表し、個々の実験の結果は白丸としてプロットされ、ひげは±SDを表す。該当する場合、データは一元配置分散分析によって統計的に評価されました。 p < 0.05を統計的に有意であると考えると、可溶性LLT1の阻害効果はLLT1SIMとは大きく異なり、NKR-P1リガンドを欠く対照条件と変わらない。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

現在、既知の 3D 構造を持つ同様の CTL:CTL NK 細胞受容体:リガンド複合体は、ヒト NKp65:KACL37 とマウス NKR-P1B:Clrb42 の 2 つだけです。これらの相同複合体は、NKR-P1:LLT1複合体の一次相互作用モードとトポロジー的に類似しています（図4b）。 NKR-P1 の細胞外部分の NKp65 との配列同一性は 33%、マウス NKR-P1B との配列同一性は 42% です。比較すると、LLT1の細胞外部分のKACLとの配列同一性は49%、マウスClrbとの配列同一性は51%である。ヒト NKp65:KACL 複合体の構造は、二量体 KACL リガンドと別々かつ対称的に相互作用する 2 つの単量体 NKp65 ユニットから構成されます。マウスNKR-P1B:Clrb複合体の結晶構造は、2つのClrb二量体がそれらの間に配置された1つのNKR-P1B二量体と相互作用していることを示しています(各Clrb二量体は2つのNKR-P1B鎖の1つと相互作用します)。マウス複合体の配置は、マウス複合体が対称である一方で、LLT1の一次相互作用モードと二次相互作用モードという2つの異なる結合界面が観察されるという事実を除けば、本明細書に提示するNKR-P1:LLT1複合体の構造と類似している。

NKR-P1:LLT1、NKR-P1B:Clrb、および NKp65:KACL 複合体のオリゴマー形態が異なるにもかかわらず、一次受容体:リガンドの相互作用は、モノマー:モノマーの重ね合わせ、つまり受容体:リガンドのペアのレベルでは 3 つのケースすべてで類似しています。モノマーは基本的に鎖全体に沿ってオーバーラップします。最も構造的に保存された領域は、通常、タンパク質のコア内で連続的に保存されたβシートです。補足図6aは、保存された3D位置、アミノ酸の種類、および少なくとも3つのアミノ酸の長さを持つフラグメントを赤色で示しています。このような基準は、次のフラグメントによって満たされます: リガンド – KCFYFS (ヒト LLT1 残基 85 ～ 90)、NWT (95 ～ 97)、WIGL (132 ～ 135)、WKW (143 ～ 145)、および WICSK (182 ～ 186) 、および受容体 – WIGL (ヒト NKR-P1 残基 153 ～ 156) および ICQ (209 ～ 211)。したがって、それらの相互作用に関しては、実際の相互作用界面よりも受容体とリガンド足場の相互の配向の方が重要であると考えられます。

我々は、3 つの相同複合体のうち少なくとも 2 つの相互作用界面に保存されている 3 つのアミノ酸相互作用ペアのみに注目しました。それらは、リガンドの残基 Tyr165-Tyr171-Phe148、Arg175-Arg181-Arg158、および Tyr177-Tyr183-Phe160 の周囲に集まっています (補足表 2 および補足図 6a)。 Clrb および KACL の場合、アルギニン残基は同等の水素結合を形成します。 LLT1 では、アルギニンは異なる立体構造をとり、Asn183 と分子内水素結合を形成します。 NKR-P1:LLT1 における主な相互作用モードは主に、高速 kon/koff 反応速度を可能にする主鎖接触に依存しており、これにより、以前に発表された SPR に基づく所見 39,40 と我々の AUC 分析が裏付けられます。したがって、トポロジー的に類似した複合体は3つのケースすべてで形成されますが、基礎となる分子間認識メカニズムは実際の折り畳みとアミノ酸組成から半独立しています（補足図6b）。ただし、二次相互作用モードは NKR-P1:LLT1 複合体に固有であり、他の関連複合体には見られません。

Y. Li and coworkers reported that the orientation of NKp65 bound to its ligand precludes the putative α2-centered dimerization of NKp6537. Similarly, a hypothetical NKp65 α1-centered dimer is also implausible based on steric hindrance and the lack of stabilizing interactions. This observation contrasts with the α1-centered dimerization of NKR-P1 present in both its unbound and complexed crystal structure. Interestingly, the single-nucleotide polymorphism (SNP) c.503 T > C of the human KLRB1 gene, causing the substitution of isoleucine 168 for threonine in the NKR-P1 CTLD, was reported to have a 37% frequency of the Thr168 alleleC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3335">51. The authors showed that the Thr168 isoform of NKR-P1 has a lower affinity to LLT1 and a weaker inhibitory effect on NK cells. They proposed that Ile168 forms a part of the interaction interface between NKR-P1 and LLT1, directly affecting LLT1 recognition by NKR-P1C polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3339">しかし、NKR-P1ホモ二量体の構造は、Ile168が膜と遠位の相互作用界面ではなく二量体化界面、より具体的には二量体化界面内の小さな疎水性ポケットに存在することを示しています（図3d）。したがって、c.503 T > C SNPによって引き起こされる非極性イソロイシン残基の極性スレオニンによる置換は、この置換がα1中心のNKR-P1ホモ二量体を不安定化するため、結合親和性に間接的に影響を与えると提案します。最近、例えばNK細胞活性化受容体NKp3052で証明されているように、グリコシル化は受容体のホモオリゴマー化に大きな影響を与えることが多い。 NKR-P1 のホモ二量体化もそのグリカンによって制御されます。具体的には、Asn116 と Asn157 に存在するグリカンです (図 3b)。これらの残基に存在するコアグリカン鎖は、α1 中心の二量体化界面に部分的に寄与しますが、同時にグリカン同士が衝突します。その結果、α1中心NKR-P1ホモ二量体の安定性は、Asn157のN-グリコシル化を廃止し、二量体界面にAsn116グリカンのみを残すことによって改善されます（補足図3b）。興味深いことに、N157S 変異を引き起こす c.470 A > G SNP もヒトゲノム変異データベースにリストされています。ただし、N157S 変異の臨床的重要性はまだ調査されていませんが、リガンド結合状態の安定化を介して NKR-P1 シグナル伝達に大きな影響を与える可能性があります。したがって、受容体のオリゴマー状態は、全体的なNKR-P1:LLT1結合親和性を調節する可能性がある。 NKp65:KACL 複合体は、その高い親和性 (Kd ~ 0.67 nM)37 で際立っています。 NKp80:AICL の 3,000 倍 (Kd ~ 2.3 μM)9、NKR-P1:LLT1 の 70,000 ～ 130,000 倍 (Kd ~ 48 μM39、この研究では 90 μM)。 NKp65:KACL 結合親和性が非常に高いため、NKp65 では、推定上の祖先のα1 中心二量体化界面が失われている可能性があります。対照的に、NKR-P1 および NKp80 受容体は、α1 中心の二量体化を利用し、結合力効果の増加を可能にすることで、リガンドに対する低い親和性を補うように進化した可能性があります。

両方の結合パートナーの単一残基変異体の SPR 解析は、J. Kamisekiryo によって行われ、公開されている LLT1 構造 39,40 に基づいて S. Kita とその共同研究者によって更新され、相互作用に不可欠な NKR-P1 と LLT1 のいくつかの重要な残基を同定しました。そして、相互作用する残基のいくつかのペアを提案しました（補足表3）。これらの SPR 研究で結合に有害または中程度の悪影響を及ぼした変異残基は、主に一次相互作用インターフェース (図 1 および補足表 3)、つまり LLT1: Tyr165、Asp167、Lys169、Arg175、Arg180、および Lys181 に見られます。 NKR-P1 では: Arg181、Asp183、Glu186、Tyr198、Tyr201、および Glu205。ただし、提案された相互作用ペアは、NKR-P1:LLT1 複合体の現在の結晶構造で観察される両方のタンパク質の相互配向と常に一致するとは限りません。たとえば、提案された LLT1/NKR-P1 ペア Tyr177/Tyr198 および Arg175/Glu200 は、観察された相互作用ペア LLT1:Tyr177:OH/NKR-P1:Ser199:O および LLT1:Arg175:N/NKR-P1:Glu200 とよく一致します。 :OE2、それぞれ。一方、LLT1 ループ L6 の Glu179 と、NKR-P1 ループ L5 の Ser193 および Thr195 との提案された組み合わせは、NKR-P1 の近くに位置する Glu179 と Arg181 (ループ L3) および Tyr198 (鎖 β4) の結晶構造接触部にのみ類似しています。ループL5。 SPR 研究とは対照的に、LLT1:Tyr165 が一次界面で使用され、Phe152 は NKR-P1 L0 相互作用領域に近いにもかかわらず、Tyr165 と Phe152 の間に接触は観察されませんでした。最後に、LLT1:Lys169 と NKR-P1:Glu205 の間に示唆されている直接結合を確認することはできません。これらの残基は一次モードでは互いに近接していますが (最も近い距離は 4.3 Å)、相互作用界面で重要な結合を形成していないことは明らかです。さらに、Lys169 側鎖は、一次モードでの電子密度マップの品質が低いことから示唆されるように、明確に定義された位置を持つ他のすべての近くの側鎖とは対照的に、かなり柔軟です。

NKR-P1:LLT1 構造で観察される二次結合モードには、一次結合モードで使用される領域とは異なる LLT1 の領域が含まれるため、この結合モードにおける LLT1 と NKR-P1 の方向は、で提案されている相互作用ペアとは一致しません。 SPR研究。それにもかかわらず、NKR-P1 対話インターフェイスはプライマリモードとセカンダリモードで非常に似ています。したがって、以前に提案された NKR-P1 相互作用残基の一部は二次モードにも関与しています (Arg181、Asp183、Tyr198、および Tyr201)。興味深いことに、残基 LLT1:Lys169 は、二次相互作用モードで NKR-P1 (Arg181、Ser199、および Glu200) とのいくつかの接触を確立します。ただし、以前に提案されたペア Lys169/Glu20539,40 もこのモードでは観察されず、これらの残基はさらに離れています (約 11 Å)。 LLT1 の一次相互作用界面と二次相互作用界面の両方に Lys169 が存在することは、この残基が複合体形成全体において重要な役割を果たしていることを示唆しています。したがって、以前に報告された LLT1 変異 Lys169Glu39,40 は、二次界面におけるいくつかの負の側鎖 (NKR-P1 の Glu200 と Asp183、および LLT1 の変異 Glu169) の共局在を引き起こし、したがって NKR の破壊が起こることを示しています。以前の SPR 実験で観察された P1:LLT1 相互作用は、一次界面ではなく二次界面の弱化に起因する可能性が最も高くなります。 J. Kamisekiryo はその後、NKR-P1 に Glu205Lys 変異を導入することで結合を回復しました。私たちの構造に基づいて、この効果は主インターフェイスを強化することによって説明されます。したがって、以前に発表されたSPRに基づく相互作用データは、現在の結晶構造でNKR-P1とLLT1の間で観察された相互作用モードとほぼ一致していますが、以前に示唆された相互作用ペアの一部は割り当てが間違っており、どちらの相互作用界面にも存在しません。

何人かの著者は、NKR-P1:LLT1複合体の低い親和性を補う相互作用に対する多量体化の親和性効果を以前に示唆しています37、40、47。興味深いことに、この複合体の現在の構造では、NKR-P1 および LLT1 ホモ二量体の反復鎖の形成が実際に観察されます。この擬似線形多量体は、2つのタンパク質の膜近位部分が反対側にあるジグザグ形状をしており（図8）、構造的にはα1/α2を中心とした交互ヘリックスのNKR-P1/LLT1ホモ二量体に基づいています。（鎖形成効果）、および一次相互作用モードと二次相互作用モードの両方の同時関与（立体効果）。反対に、一次モードのみに関与するNKR-P1:LLT1の人工的に構築された多量体モデルは、非線形でほぼらせん状の立体構造を持つホモ二量体の鎖を示します（補足図6c）。さらに、NKR-P1 ストーク領域は立体的に衝突し、LLT1 ストーク領域は複合コアの外側にさまざまな方向に露出します。したがって、そのような多量体は、免疫シナプス内での細胞膜の固定および形成に適合しない可能性が高い。二次モードのみに関与するNKR-P1:LLT1は、複合体コアの外側の多くの異なる方向を向いている受容体領域とリガンドストーク領域の両方を備えたらせん多量体も形成します（補足図6d）。同時に、一次相互作用モードと二次相互作用モードの両方でLLT1二量体に結合すると、隣接するNKR-P1分子は相互のアクセサリー接触を引き起こし、アセンブリ全体の安定性に少なからぬエネルギー的寄与をもたらします（図4a、黒い星）。このアクセサリー接触は、NKR-P1とLLT1自体の間の二次結合界面と同様の数の水素結合とサイズを包含しており（補足図6e）、したがって、一次結合と二次結合の組み合わせに有利な追加の安定化要素と考えることができます。単一のモードではなく、複数のモードを使用します。

a Representation of four adjacent asymmetric units within the NKR-P1:LLT1 complex crystal, excluding the additional unrelated NKR-P1 dimer. The NKR-P1 (blue and cyan) and LLT1 (green and lemon) dimers alternate in primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) interactions, forming a chain-like structure. The schematic depiction of this arrangement is shown in the inset with the same color code. The black and white triangles represent N-termini positions, pointing behind and in front of the display plane, respectively. b Depiction of the hypothetical arrangement of the chain-like structure upon contact of an NK cell (bottom, blue) with a target cell (top, green) showing the crystal structure of two NKR-P1 dimers (cyan and blue) interacting with two LLT1 dimers (green and lemon) in the primary (cyan and green) and secondary (blue and lemon) modes. The first three N-terminal residues in the structures are highlighted in red. The flexible stalk regions connecting the N-termini and cell membranes are represented as speckled lines of the corresponding color-coding. The view on the right-hand side is clipped for clarity at the plane indicated on the left-hand side view. c Schematic depiction of NKR-P1 extracellular domain dynamics and possible ligand binding arrangements. NKR-P1 is expressed as a disulfide-linked homodimer; however, its CTLDs may undergo conformation change similar to monomer-dimer equilibrium. Such putative equilibrium would be shifted towards monomeric species for the wild-type protein and its I168T allelic variantC polymorphism in the human KLRB1 gene alters ligand binding and inhibitory potential of CD161 molecules. PLoS One 10, e0135682 (2015)." href="/articles/s41467-022-32577-6#ref-CR51" id="ref-link-section-d57927382e3460">同時に、本明細書に記載の結晶構造で観察される非共有結合二量体に対応する二量体配置は、S159A変異体(左側)について促進されるであろう。このようなNKR-P1二量体は、以前に提案されたNK細胞受容体とCTLリガンドの相互作用の標準モデルにおいて、同族LLT1リガンド（それ自体もジスルフィド結合ホモ二量体としても発現され、CTLDと安定な非共有結合二量体を形成する）と相互作用する可能性がある。（中央）、またはNKR-P1:LLT1複合結晶構造に基づいて提案された鎖状配置の二量体リガンドと交互になります（右側）。

NKR-P1:LLT1のこのようなジッパー状オリゴマーが結晶中およびある程度の溶液中（図5および補足図5）だけでなく細胞表面でも発生するかどうかを判断するために、単一分子局在顕微鏡を使用して、可溶性 LLT1 および LLT1SIM の存在下または非存在下で、抗 NKR-P1 AlexaFluor® 647 mAb で標識された全長 NKR-P1 トランスフェクタントを調べます (図 6)。 LLT1を添加すると、蛍光イベントのNKR-P1クラスターのサイズと面積の大幅な増加が観察されましたが、二次相互作用モードの変異体であるLLT1SIMは観察されませんでした。一方の結合パートナーが膜に埋め込まれ、もう一方が可溶性として提示される実験設定は、細胞間接触の生物学的現実を完全には説明していませんが、相互作用を 2 つの隣接する細胞の膜間の 2 次元空間に限定すると仮定します。完全長のジスルフィドタンパク質の場合は、それを強化するだけです。我々の実験は、NKR-P1受容体がLLT1の二量体種と結合すると細胞膜内でクラスター（架橋オリゴマー）を形成する能力の仮説を検証することを目的とした。この実験設定により、溶液中に主に二量体 LLT1 が存在することを確認しながら、測定全体を通じて LLT1 の濃度を正規化することができました。さらに、純粋に一次または二次モードに基づくモデルを含むすべての可能なモデルのライブラリ全体が含まれていたにもかかわらず、私たちのSEC-SAXSデータは、交互の一次相互作用モードと二次相互作用モードの多量体鎖に最もよく適合しました（補足図5）。分析では。許容可能な χ2 値は、主に交互配置を含む多量体モデルで得られました。まとめると、NK 細胞媒介細胞毒性アッセイの結果によってさらに裏付けられるように、生物学的に妥当な多量体相互作用には両方の相互作用モードを組み合わせることが必要であると結論付けられます (図 7)。

NK CTLR のこのような機能的多量体化はほとんど見落とされてきましたが、KIR の免疫グロブリンファミリーと MHC クラス I 糖タンパク質の間の相互作用や、KIR2DL1 と NKG2D54 の間の相互作用については、同様のナノクラスターの形成がよく説明されています。さらに、共刺激免疫複合体 B7-1:CTLA-4 および B7-2:CTLA-455,56 の結晶構造では、相互作用する二量体の周期的なジッパー状ネットワークが報告されています。興味深いことに、B7-1 は単量体と非共有結合性二量体の間の動的平衡状態で細胞表面に発現します。共刺激受容体 CD28 と相互作用すると、B7-1 は B7-1 と CD28 ホモ二量体から構成される相互作用ネットワークを形成します。この相互作用の脱共役は、B7-1 の単量体への解離によって促進されますが、B7-1 偏性二量体の挿入により、抗原提示細胞と T 細胞間の異常なシグナル伝達が長期化します 57。

完全長タンパク質として、LLT1 と NKR-P1 は両方とも細胞表面に共有結合性ジスルフィドホモ二量体を形成しますが 7,36、我々の知る限り、それらの CTL 細胞外ドメインの二量体状態は生細胞ではまだ評価されていません。逆に、可溶性 LLT1 細胞外ドメインのヘリックス α2 中心の非共有結合性ホモ二量体の形成は以前に特徴づけられており 40,43,44 、全長タンパク質内でも同様に起こる可能性があります。ヒト NKR-P1 ヘリックス α1 中心二量体は、分子間接触が少なく、ヘリックス α2 中心二量体 CTLR よりも接触表面積が小さいため、安定性が低くなります。それにもかかわらず、全長NKR-P1受容体ジスルフィドホモ二量体の状況では、その形成が増加すると予想される。同時に、NKR-P1 ストーク領域の長さ (25 アミノ酸) は、全長受容体自体のジスルフィドホモ二量体内の CTLD 単量体/二量体の平衡に十分な柔軟性を与え、その後、多型とグリコシル化によってさらに制御されると考えられます。 NKR-P1二量体化界面の不均一性（図8c、左下）。したがって、B7-1:CD28システムと同様に、CTL細胞外ドメインの単量体状態と二量体状態の間の平衡により、NKR-P1がLLT1と安定した高次複合体を形成する能力を修飾および微調整することで、結果的に強度を調節する可能性がある。一方、免疫シナプス内のLLT1によるNKR-P1の架橋は、この低親和性相互作用複合体による安定したシグナル伝達に十分な結合力を提供する可能性があります。

結論として、提示されたデータは、NKR-P1:LLT1複合体の結晶構造が、細胞表面上でのC型レクチン様NK細胞受容体:リガンド多量体化の新しい方法を構成しており、リガンド結合が受容体を介した低親和性をどのように克服するかを説明していることを示しています。免疫シナプス内の架橋。

可溶性 LLT1 細胞外ドメイン (Gln72-Val191) の安定化された H176C 型は、以前に記載されているように、HEK293S GnTI- 細胞で一時的に発現されました 44。 N120R、R153E、K169A 二次相互作用モード変異体 LLT1SIM を同様の方法でクローニングし、作製しました。ヒト NKR-P1 の C 型レクチン様ドメインは、安定にトランスフェクトされた HEK293S GnTI- 細胞でも同様に産生されました 50。簡単に説明すると、NKR-P1 の細胞外 CTL ドメイン (Gly90-Ser225) に対応する発現構築物を、N 末端分泌リーダーとC 末端 His タグ (分泌タンパク質の N 末端と C 末端にそれぞれ ETG と KHHHHHH を持つ)。 HEK293S GnTI- 細胞 58 の浮遊培養物を、発現プラスミドと 25 kDa 直鎖状ポリエチレンイミンの 1:3 (w/w) 混合物でトランスフェクトしました。安定にトランスフェクトされた細胞プールは、200 ng/μl G418 で 3 週間以内に選択されました。分泌タンパク質は、採取した培地から 2 段階クロマトグラフィーによって精製しました。IMAC は Talon カラム (GE Healthcare) で実行され、続いて SEC は Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) で 10 mM HEPES pH 7.5 中で実行されました。 150 mM NaCl および 10 mM NaN3。 dSTORM 顕微鏡検査および in vitro NK 細胞アッセイ (以下を参照) では、バッファーを組織培養グレードの PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.4) に交換しました。脱グリコシル化のために、GST 融合 Endo F159 を、50 mM クエン酸塩 pH 5.5 を含む SEC 緩衝液中のタンパク質に対して 1:100 の重量比で添加し、37 °C で 2 時間インキュベートしました。次いで、脱グリコシル化されたタンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのバッチアフィニティークロマトグラフィー、続いて上記のようにＳＥＣによって精製した。

グリコシル化された NKR-P1 (構造 NKR-P1_glyco) – SEC 緩衝液中 20 mg/ml の可溶性ヒト NKR-P1 細胞外ドメインを、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して結晶化しました。 Cartesian Honeybee 961 ロボット (Genomic Solutions) を使用して 294 K でドロップ (100 nl のリザーバー溶液と 100 nl のタンパク質溶液) をセットアップしました。リザーバーは 20% (w/v) PEG 3350、200 mM 二ナトリウムで構成されました。酒石酸塩 pH 7.2 (PEG/イオンスクリーン、条件 36; Hampton Research)。寸法 150 × 150 × 20 µm の六角形の結晶を、25% (v/v) エチレングリコールを添加したリザーバー溶液に浸漬することにより凍結保護しました。

脱グリコシル化された NKR-P1 (構造 NKR-P1_deglyco) – Endo F1 脱グリコシル化された可溶性ヒト NKR-P1 外部ドメインを 12 mg/ml に濃縮し、上記のように結晶化しました。リザーバーは、20% (w/v) PEG 3350、200 mM フッ化アンモニウム、および 200 mM 塩化リチウム pH 6.2 から構成されました (PEG/イオンスクリーン、条件 3、添加剤スクリーン、条件 17; Hampton Research)。 50 × 50 × 150 μm の棒状結晶を、25% (v/v) グリセロールを添加することにより上記と同様に凍結保護しました。

NKR-P1:LLT1 複合体 (構造 NKR-P1:LLT1) – Endo F1 脱グリコシル化された可溶性ヒト NKR-P1 および LLT1 細胞外ドメインを 1:1 モル比で混合し、総タンパク質濃度 8 mg/ml まで濃縮しました。タンパク質複合体は上記のように結晶化されました。２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ３３５０、２００ｍＭフッ化アンモニウムｐＨ中で増殖させた脱グリコシル化ＮＫＲ－Ｐ１の破砕針状結晶の原液５０ｎｌを液滴（２００ｎｌのリザーバーおよび１００ｎｌのタンパク質溶液）に播種した。 6.2 (PEG/イオンスクリーニング、条件 3; Hampton Research)。リザーバーは、200 mM 硫酸アンモニウム、20% (w/v) PEG MME 5000、100 mM Tris pH 7.5 (Proplex スクリーン、条件 1-40; Molecular Dimensions) から構成されていました。寸法 30 × 30 × 80 μm の正方両錐形結晶を、上で詳述したように、25% (v/v) グリセロールを添加することによって凍結保護した。

すべての回折データは、Diamond Light Source (Harwell, UK) のビームライン I03 で、波長 0.97625 Å および PILATUS3 6 M 検出器を使用して収集されました。結晶と検出器の距離は 340 mm、画像あたりの露光時間は 0.02 秒、振動幅は 0.1°、温度は 100 K に設定されました。各データセットに対して 7200 枚の画像が収集されました。 NKR-P1:LLT1 複合体の場合、最終的にデータ処理に使用された画像は 5000 枚のみでした。すべての回折画像は XDS パッケージ 60 を使用してインデックス付けおよび統合され、AIMLESS61 を使用してスケーリングされ、ランダムに選択された反射の 5% が Rfree セットとして利用されました。位相問題は分子置換 – NKR-P1_glyco: プログラム BALBES62 で、E-カドヘリンに結合したヒト NK 細胞受容体 KLRG1 の構造を使用することで解決されました (https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/pdb)63。 NKR-P1_deglyco: マウス NKR-P1A を使用して PHASER64 で見つかった 6 つの鎖 (https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb)65 は、MOLREP66 で見つかった 2 つの鎖で完成しました。 NKR-P1:LLT1: BALBES で NKR-P1 鎖として見つかった 4 つの鎖 (マウスデクチン-1 の構造を使用、https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb)48 は、MOLREP でさらに 2 つの鎖で完成しました。そして、6 つのチェーンすべてが 4 つの NKR-P1 チェーンおよび 2 つの LLT1 チェーンとして手動で再解釈されました。改良は、REFMAC567 と COOT68 での手動編集を使用して実行されました。改良の最後のサイクルは、すべての反射を使用して完了しました。最終的なデータ処理と構造パラメーターの概要を表 1 に示します。

NKR-P1_glyco – グリコシル化ヒト NKR-P1 CTLD の 1 つの二量体からなる構造は、電子密度マップで全体的に明確に定義されており、構造の高分解能 (1.8 Å) に対応します。二量体化界面でのグリコシル化は、脱グリコシル化された NKR-P1 の構造で観察される重複する特徴を示しません (下記)。 GlcNAc は両方の鎖が完全に占有された Asn116 をモデルにしましたが、電子密度マップでは Asn157 でのグリコシル化は観察されませんでした。モデル化されたすべてのグリコシル化鎖 (A/Asn169 の GlcNAc2Man5、B/Asn169 の GlcNAc2Man3、および両鎖の残基 Asn116 の GlcNAc) は、電子密度マップ内でよく局在化されています。

NKR-P1_deglyco – 非対称ユニットは、最初の GlcNAc ユニットの後に脱グリコシル化されたヒト NKR-P1 CTLD の 4 つの二量体で構成されます。タンパク質鎖の局在部分の長さは、モデル化された残基 Leu91 ～ Leu214 を含む最短の鎖 A、F、および G から、残基 Gly90 ～ Arg218 を含む最長の鎖 H まで変化します。残基 Asn169 の GlcNAc はよく局在化していますが、二量体化界面で Asn116 および Asn157 に結合した GlcNAc ユニットは、代替の重複位置に存在します。残基 Asn116 も代替配座異性体を示します。 Asn157 および Asn116 に結合した GlcNAc ユニットは 0.5 占有率でモデル化され、重複する各ペアから最も異なるユニットのみがモデル化されました (表 1)。

NKR-P1:LLT1 – 非対称ユニットには、ヒト NKR-P1 CTLD の 2 つの二量体と LLT1 CTLD の 1 つの二量体が含まれています。この構造には明確に定義された電子密度マップがあり、すべてのタンパク質鎖を明確に割り当てることができます。最も明確な差のピークは、解釈できない小さなリガンドに対応します。 LLT1 は、残基 Asn95 および Asn147 によく局在化した GlcNAc ユニットを持っています。 NKR-P1 の局在化 GlcNAc ユニットは、NKR-P1_deglyco 構造 (前の段落) で同定されたものと同じです。

野生型と S159A NKR-P1、および野生型と SIM LLT1 の円二色性 (CD) スペクトルは、Pro-Data Chirascan ソフトウェア (Applied Photophysics) と 0.1 cm 光路長石英セルを備えた Chirascan Plus CD 分光偏光計を使用して記録しました。スペクトルは、室温で 195 ～ 260 nm の波長範囲にわたって 1 nm 刻みで記録されました。サンプル濃度は、10 mM HEPES、150 mM NaCl pH 7.5サンプルバッファー中、NKR-P1およびLLT1タンパク質サンプルについてそれぞれ0.2 mg/mlおよび0.3 mg/mlでした。 CD シグナルは楕円率として表され、結果として得られたスペクトルはバッファーから差し引かれました。二次構造組成は、CDNN 2.1 ソフトウェア (Applied Photophysics) を使用して分析しました。

NKR-P1:LLT1 複合体形成と NKR-P1 S159A 変異体の二量体化を分析用超遠心分離機 ProteomeLab XL-I (Beckman Coulter) で分析しました69。沈降速度実験では、グリコシル化 NKR-P1、LLT1、および SEC 緩衝液中の濃度を増加させたそれらの等モル混合物のサンプルを、An-50 Ti ローター (Beckman Coulter) で 48,000 rpm、20 °C で回転させ、スキャンを 150 回行いました。吸光光学系を使用して、0.003 cm の空間分解能を 5 分ごとに記録しました。遠心分離機は、ProteomeLab ソフトウェア (Beckman Coulter) を使用して操作されました。緩衝液密度およびタンパク質の部分比容積は、SEDNTERP (http://www.jphilo.mailway.com) で推定されました。データは、連続 c(s) 分布モデルを使用して SEDFIT70 で分析されました。結合等温線（および AUC データを示す図）は GUSSI71 で作成され、ヘテロ結合モデル A + B ⇔ AB または A + B ⇔ AB + B ⇔ ABB を使用して SEDPHAT72 で最適に適合されました。ここで、A は LLT1 二量体、B はそれぞれNKR-P1モノマー。 KD と AB または ABB の沈降係数のみが当てはめに含まれました。他のパラメータは既知の値で一定に保たれました。

NKR-P1:LLT1 および NKR-P1:LLT1SIM 相互作用のマイクロスケール熱泳動 (MST) 測定では、NKR-P1 を Atto 488 NHS エステル (Merck) で pH 6.5 で蛍光標識しました。過剰なラベルはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去されました。蛍光標識した 100 nM NKR-P1 を LLT1 または LLT1SIM の希釈系列と混合し、MO.Control ソフトウェア (NanoTemper)、30% LED 励起電力、および 60% MST 電力を使用して、NT.115 モノリス内の標準キャピラリーで分析しました。生データは PALMIST73 で分析されました。エクスポートされた等温線は SEDPHAT72 で最もよく適合し、図は GUSSI71 で作成されました。

NKR-P1:LLT1 複合体の SEC-SAXS データは、2.4 mL Superdex 200 カラム (GE Healthcare)、Pilatus P3-2M 検出器を備えた Agilent 1200 HPLC システムを使用して、ビームライン 21 のダイヤモンド光源 (英国ディドコット) で収集されました。、12.4 keVの放射線、およびサンプルから検出器までの距離は4.014 mです。 10 mM HEPES、150 mM NaCl、10 mM NaN3、pH 7.5で希釈したGlcNAc2Man5グリカンを含むヒトNKR-P1およびLLT1細胞外ドメインを1:1のモル比で混合した。データは、15 mg/ml の負荷濃度で緩衝液およびタンパク質サンプルについて 293 K で収集されました。選択した間隔 (フレーム 355 ～ 367、368 ～ 378、379 ～ 388、388 ～ 399、431 ～ 440、481 ～ 491) のデータは、SCÅTTER (Diamond Light Source の Robert Rambo によって開発、https: //www.bioisis.net/tutorials/9)、その後、ATSAS74 パッケージを使用して個別にマージおよび特性評価を行います。データ品質の証明として、間隔 389 ～ 399 (最初のピークからのサンプルデータ範囲) および 481 ～ 491 (aサンプルデータの範囲は 2 番目のピークからです)。すべてのデータ範囲の散乱プロットとギニエプロットを補足図5に示します。SAXSデータとNKR-P1:LLT1複合体の3D結晶構造の間の一致は、OLIGOMER75を使用して評価されました。一次相互作用モードと二次相互作用モードのさまざまな順列における単量体、二量体、およびそれらの相互作用多量体を表す NKR-P1 および LLT1 構造モデルのライブラリは、対称操作を適用することによって、ここで解決された結晶構造から PyMOL で生成されました (合計 49 の異なるモデル)。次に、OLIGOMER アルゴリズムは、すべての個々の散乱曲線と、選択された 6 つのマージされたデータ間隔から得られる曲線に最もよく適合する組み合わせを選択するように残されました (補足データ 1 および補足図 5)。

完全長 NKR-P1 安定トランスフェクタントは、ドキシサイクリン誘導性タンパク質発現を備えた piggyBac トランスポゾンベースのシステムを使用して、HEK293S GnTI- 細胞株で生成されました 76。顕微鏡サンプルは、5 ng/ml ドキシサイクリンで一晩処理した細胞から調製しました。細胞をPBSで洗浄し、PBS中の8.4 mg/ml LLT1またはLLT1SIMまたはPBS単独とともに37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を 37 °C で 25 分間、PLL コーティングされたスライドガラスの表面に定着させました。次いで、細胞を4% PFAおよび0.2% GAで室温で10分間固定し、PBSで3回洗浄した。抗体染色では、まず細胞を 5% BSA で 30 分間ブロックし、ブロッキング溶液中の 10 μg/ml の Alexa Fluor® 647 抗ヒト CD161 抗体 (クローン HP-3G10; BioLegend) で 60 分間染色しました。サンプルを PBS で 5 回洗浄した後、4% PFA および 0.2% GA で 10 分間後固定しました。最後に、細胞を15 mM NH4Clで処理し、PBSで2回洗浄した。 dSTORM 画像は、Zen Black エディションソフトウェア (Carl Zeiss) を使用して Elyra PS.1 で取得されました。基準マーカー (FluoSpheres F8801; Thermo Fisher) を PBS で希釈し、サンプル上に 1 時間放置しました (ビーズストックの最終希釈は 100,000 倍でした)。各測定の前に、バッファーをグルコースオキシダーゼ/カタラーゼ/MEAベースのイメージングバッファーに交換し、バッファーの酸化を防ぐためにサンプルをカバーガラスとシリコンで密閉しました。各セルについて、642 nm レーザー出力 100%、開口数 1.46、油浸対物レンズ 100 倍を使用し、露光時間 15 ms の HP TIRF 照明モードで 2 × 104 の生画像を取得しました。すべての実験で単一の測定内で一貫した標識を確保するために、同じバッチと濃度の抗体を使用しました。さらに、研究全体にわたって一貫した全体的なデータ品質を確保するために、一連の個々の測定において可溶性リガンドの有無にかかわらず常に条件を測定しました。

超解像度 dSTORM 画像は、ImageJ 処理ソフトウェア 78 用の ThunderSTORM プラグイン 77 を使用して、生の画像シーケンスから再構成されました。分子のサブピクセル位置特定は、最尤推定フィッティング法を使用して統合ガウス点広がり関数モデルをフィッティングすることによって実行されました79。再構成された dSTORM 画像は、基準マーカーを使用してドリフトを補正し、後続のフレーム (5 フレームのオフギャップで) に現れる 20 nm 以内のイベントをマージすることにより、単一ソースからの複数の位置を補正しました。ボロノイテッセレーションクラスター分析は、ClusterViSu80 で細胞内部表面全体に対して実行されました (細胞エッジおよびその他の集中した膜領域は分析から除外されました)。閾値 250 は、実験領域の局在化と同じイベント密度のランダム化された領域間のボロノイポリゴンサーフェス値の分布を比較することによって選択されました。 2 つ未満の蛍光イベントを含むクラスターはデータセットから除外されました。 OriginPro 2018 では、複数の平均をボンフェローニ補正を使用した一元配置分散分析 (ANOVA) と比較しました。グラフは平均値を示し、エラーバーは SD を表します。p > 0.05 の値は有意ではないことを示します。統計的に有意な p 値はアスタリスクで示されます (*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001)。

初代NK細胞の細胞傷害活性の阻害に対するLLT1またはLLT1SIMの影響は、フローサイトメトリーによって評価されました。ヒト NK 細胞分離用のバフィーコートは、研究用の材料として血液学および輸血研究所 (IHBT、プラハ、チェコ共和国) から購入しました。 IHBT はドナーの同意を手配しました。初代NK細胞は、NK細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を製造業者のプロトコールに従って使用し、ネガティブ選択によって単離した。精製した NK 細胞を、10% FCS、100 単位/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、および 80 ng/ml IL-2 (Sigma-Aldrich) を添加した RPMI 1640 中で 1 × 106 細胞/ml で一晩培養し、活性化しました。。 K562 標的細胞を CellTrace Violet Proliferation Kit (Thermo Fisher) で染色しました。染色後、1 × 104 個の標的細胞を活性化 NK 細胞と 40:1 (E:T) の比率で混合し、LLT1 または LLT1SIM タンパク質を添加して、最終反応量を 20 μl (K562 6.5 μl および 6.5 μl) に保ちました。 NK 細胞懸濁液 μl および PBS 中の濃縮タンパク質ストック溶液 7 μl、最終タンパク質濃度 50 または 250 μM)。 4 時間のインキュベーション後、細胞混合物を 300 × g で遠心分離し、1 μg/ml 7-AAD で染色しました。細胞は、BD LSR II フローサイトメーターと BD FACSDiva ソフトウェア (BD Biosciences) を使用して、3 人の異なる健康なドナーからの NK 細胞を 3 回使用して実行された 3 つの独立した細胞毒性アッセイで分析されました。データはFlowJoソフトウェア(BD Biosciences)で分析した。フローサイトメトリー分析のゲーティング戦略を補足図7に示します。データはSDを使用した測定値の平均として表示されます。該当する場合、データは一元配置分散分析によって統計的に評価され、p < 0.05の値は統計的に有意であるとみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で報告された X 線結晶構造の精密な座標および構造因子ファイルは、Protein Data Bank (https://www.wwpdb.org) によって検証され、https://doi のアクセッション番号でそこに寄託されています。 .org/10.2210/pdb5MGR/pdb (NKR-P1_glyco)、https://doi.org/10.2210/pdb5MGS/pdb (NKR-P1_deglyco)、および https://doi.org/10.2210/pdb5MGT/pdb (NKR- P1:LLT1)。このペーパーの他の PDB エントリへのリンクは、https://doi.org/10.2210/pdb2BPD/pdb、https://doi.org/10.2210/pdb2CL8/pdb、https://doi.org/10.2210/pdb3FF7/ です。 pdb、https://doi.org/10.2210/pdb3T3A/pdb、https://doi.org/10.2210/pdb4IOP/pdb、https://doi.org/10.2210/pdb4QKI/pdb、https://doi。 org/10.2210/pdb5J2S/pdb、および https://doi.org/10.2210/pdb6E7D/pdb。回折データは、コード 778 (NKR-P1_glyco; https://doi.org/10.15785/SBGRID/778) で SBGrid データバンクに保管されています。 779 (NKR-P1_deglyco、https://doi.org/10.15785/SBGRID/779) および 780 (NKR-P1:LLT1; https://doi.org/10.15785/SBGRID/780)。 SEC-SAXS 実験からの回折データは Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/268ww2m4j31)81 に寄託されています。 SEC-SAXS データの OLIGOMER 分析の合計出力は、補足データ 1 として利用できます。ソースデータはこの文書に提供されます。

ヴィヴィエ、E. et al. 自然免疫か適応免疫か? ナチュラルキラー細胞の例。サイエンス 331、44–49 (2011)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cerwenka, A. & Lanier, LL 感染症、炎症、がんにおけるナチュラルキラー細胞の記憶。ナット。イミュノール牧師。 16、112–123 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

WM 横山 & Plougastel BF ナチュラルキラー遺伝子複合体によってコードされる免疫機能。ナット。イミュノール牧師。 3、304–316 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bartel, Y.、Bauer, B. & Steinle, A. ヒトのナチュラルキラー遺伝子複合体にコードされている遺伝的に結合した C 型レクチン様受容体/リガンドのペアによる NK 細胞機能の調節。フロント。イムノール。 4, 362 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zelensky, AN & Gready, JE C タイプのレクチン様ドメインスーパーファミリー。 FEBS J. 272、6179–6217 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロズベスキー、D. et al. 化学合成されたグリカンおよびペプチドに対する組換えリンパ球受容体 NKR-P1A および CD69 の結合特性の再評価。内部。Ｊ．Ｍｏｌ．科学。 15、1271–1283 (2014)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lanier, LL、Chang, C. & Phillips, JH ヒト NKR-P1A。 NK および T リンパ球のサブセットによって発現される C 型レクチンスーパーファミリーのジスルフィド結合ホモ二量体。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 153、2417–2428 (1994)。

CAS PubMed Google Scholar

Spreu, J. et al. C 型レクチン様受容体 NKp65 と KACL の相互作用により、ヒトケラチノサイトの専用の免疫認識が促進されます。手順国立アカデミー。科学。 USA 107、5100–5105 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Welte, S.、Kuttruff, S.、Waldhauer, I. & Steinle, A. NKp80-AICL 相互作用によるナチュラルキラー細胞と単球の相互活性化。ナット。イムノール。 7、1334–1342 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vogler, I. & Steinle, A. NKC の対比: ナチュラルキラー遺伝子複合体 (NKC) 内の遺伝的にリンクされたナチュラルキラー細胞受容体/リガンドのペア。 J. 自然免疫。 3、227–235 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Aldemir, H. et al. 最先端: レクチン様転写物 1 は CD161 受容体のリガンドです。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 175、7791–7795 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ローゼン、DB et al. 最先端: レクチン様転写物-1 は、阻害性ヒト NKR-P1A 受容体のリガンドです。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 175、7796–7799 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Poggi, A.、Costa, P.、Tomasello, E. & Moretta, L. ヒト NK 細胞における IL-12 誘導による NKRP1A 発現の上方制御と、その結果として生じる NKRP1A 媒介による NK 細胞活性化の下方制御。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 28、1611–1616 (1998)。

3.0.CO;2-6" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291521-4141%28199805%2928%3A05%3C1611%3A%3AAID-IMMU1611%3E3.0.CO%3B2-6" aria-label="Article reference 13" data-doi="10.1002/(SICI)1521-4141(199805)28:053.0.CO;2-6">論文 CAS PubMed Google Scholar

Exley, M.、Porcelli, S.、Furman, M.、Garcia, J. & Balk, S. インバリアント V α 24 J α QT 細胞受容体を発現するヒト T 細胞の CD1d 依存性活性化の CD161 (NKR-P1A) 共刺激アルファチェーン。 J.Exp. 医学。 188、867–876 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アッシャー、JE et al. MAIT 細胞サブセットを含む CD161++ CD8+ T 細胞は、TCR 非依存的に IL-12+IL-18 によって特異的に活性化されます。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 44、195–203 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ファーガソン、JR 他 CD161 は、異なるヒト T 細胞系統にわたる転写および機能の表現型を定義します。 Cell Rep. 9、1075–1088 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャーメイン、C.ら。病原体およびインターフェロンガンマによるレクチン様転写物 1 (LLT1) タンパク質の細胞表面発現の誘導は、免疫応答の調節に寄与します。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 286、37964–37975 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベネット、IM et al. インターロイキン 12 の存在下でインビトロで分化するナチュラルキラー NKR-P1A+/CD56-/CD16- 機能的に未熟なヒト NK 細胞サブセットの定義。J. Exp. 医学。 184、1845–1856 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cosmi、L.ら。ヒトインターロイキン 17 産生細胞は、CD161+CD4+ T 細胞前駆体に由来します。 J.Exp. 医学。 205、1903 ～ 1916 年 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マシューソン、ND et al. 単一細胞分析により、神経膠腫浸潤 T 細胞で同定された抑制性 CD161 受容体。セル 184、1281 ～ 1298 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Poggi, A.、Costa, P.、Zocchi, MR & Moretta, L. CD4+ NKRP1A+ ヒト T リンパ球の表現型および機能分析。 NKRP1A 分子が経内皮遊走に関与していることを示す直接的な証拠。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 27、2345–2350 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chalan, P. et al. 関節リウマチにおける CD161 のリガンドであるレクチン様転写物 1 の発現。 PLoS One 10、e0132436 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

ローゼン、DB et al. ヒトNKR-P1Aと、活性化された樹状細胞およびB細胞上で発現されるそのリガンドLLT1との間の相互作用の機能的影響。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 180、6508–6517 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Boles, KS、Barten, R.、Kumaresan, PR、Trowsdale, J. & Mathew, PA ヒト NK 細胞上で発現される新規レクチン様受容体のクローニング。免疫遺伝学 50、1-7。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロス、P.ら。悪性神経膠腫細胞は、レクチン様転写物-1 の発現を通じて抗腫瘍免疫応答に対抗します。がん研究所 67、3540–3544 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mathew, SO、Chaudhary, P.、Powers, SB、Vishwanatha, JK & Mathew, PA 前立腺がん細胞上の LLT1 (OCIL、CLEC2D) の過剰発現は、LLT1-NKRP1A (CD161) 相互作用を介して NK 細胞媒介死滅を阻害します。オンコターゲット 7、68650–68661 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マルフォ、AM et al. LLT1 (CLEC2D、OCIL)-NKRP1A (CD161) 相互作用をブロックすると、トリプルネガティブ乳がん細胞のナチュラルキラー細胞媒介溶解が促進されます。午前。Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． 8、1050–1063 (2018)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ジャーメイン、C.ら。レクチン様転写物 1 は、ナチュラルキラー細胞の機能を低下させる胚中心由来の B 細胞非ホジキンリンパ腫のマーカーです。腫瘍免疫学 4、e1026503 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zambrano-Zaragoza、JF、Romo-Martinez、EJ、Duran-Avelar Mde、J.、Garcia-Magallanes、N.、Vibanco-Perez、N. 自己免疫疾患および感染症における Th17 細胞。 Int. J. Inflam. 2014、651503 (2014)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

アフザリ、B.ら。 CD161 の発現は、STAT3 依存的に IL-17 を産生するヒト制御性 T 細胞の亜集団を特徴づけます。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 43、2043–2054 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Billerbeck、E. et al. ヒト CD8+ T 細胞上の CD161 発現の分析により、組織ホーミング特性を持つ明確な機能サブセットが定義されます。手順国立アカデミー。科学。 USA 107、3006–3011 (2010)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, JA & Colbert, RA レビュー: 脊椎関節炎の病因におけるインターロイキン 23/インターロイキン 17 軸: Th17 以降。関節炎リウマトール。 66、231–241 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brucklacher-Waldert, V.、Stuerner, K.、Kolster, M.、Wolthausen, J. & Tolosa, E. 多発性硬化症におけるヘルパー 17 細胞の表現型および機能的特徴付け。ブレイン 132、3329–3341 (2009)。

論文 PubMed Google Scholar

Estrada-Capetillo、L. et al. 関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス患者における単球由来樹状細胞によるTh17リンパ球およびTreg細胞の誘導。クリン。開発者イムノール。 2013、584303 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Michalak-Stoma, A. et al. 乾癬患者における選択された Th17 および Th22 サイトカインの血清レベル。ディス。マーカー 35、625–631 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

ジャーメイン、C.ら。 CLEC2D 遺伝子の選択的スプライシング転写バリアントの特性評価。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 285、36207–36215 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, Y.、Wang, Q.、Chen, S.、Brown, PH & Mariuzza, RA ケラチノサイトリガンドに結合した NKp65 の構造は、ナチュラルキラー遺伝子複合体における遺伝的に関連した認識の基礎を明らかにします。手順国立アカデミー。科学。 USA 110、11505–11510 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bauer, B.、Spreu, J.、Rohe, C.、Vogler, I. & Steinle, A. KACL の膜遠位表面の重要な残基は、グリコシル化ではなく、ケラチノサイト特異的な C-結合の機能的相互作用を決定します。タイプレクチン様受容体 KACL とその高親和性受容体 NKp65。免疫学 145、114–123 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamishiryo, J.、Fukuhara, H.、Okabe, Y.、Kuroki, K. & Maenaka, K. ヒト CD161 タンパク質 (NKRP1A/KLRB1) による LLT1 タンパク質認識の分子基盤。Ｊ．Ｂｉｏｌ．化学。 286、23823–23830 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

北晋ほかナチュラルキラー受容体-P1Aのリガンドであるヒトレクチン様転写産物1（LLT1）の細胞外ドメインの結晶構造。ユーロ。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 45、1605–1613 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アギラール、OA et al. ウイルス性イムノエバシンは、典型的なナチュラルキラーを標的とすることで自然免疫を制御します。細胞受容体ファム。セル 169、58–71 (2017)。

CAS Google スカラー

バラジ、GR et al. 抑制性NKR-P1B受容体による宿主Clr-bの認識は、欠落した自己認識の基礎を提供します。ナット。共通。 9、4623 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

スカロバ、T.ら。ヒト NKR-P1 のリガンドであるヒト LLT1 のさまざまなグリコシル化およびオリゴマー化状態の 4 つの結晶構造。アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 71、578–591 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blaha, J.、Pachl, P.、Novak, P. & Vanek, O. 懸濁液に適応した HEK293S GnTI(-) 細胞の高密度トランスフェクションによる、ナチュラルキラー細胞受容体 LLT1 の可溶性かつ安定な細胞外ドメインの発現と精製。プロット。 Expr. プリフ。 109、7–13 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Vanek, O. et al. 並外れた物理的および化学的安定性を持つように最適化された可溶性組換え CD69 受容体は、長期間の循環を示し、マウスの血液中にそのまま残ります。 FEBS J. 275、5589–5606 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コレンコ、P. et al. 新規ポリマーを使用したヒト CD69 の細胞外ドメインの高解像度構造。アクタクリスタログル。宗派。 F. 構造体。バイオル。クリスタ。共通。 65、1258–1260 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スカロバ、T.ら。マウス Clr-g、NK 細胞活性化受容体 NKR-P1F のリガンド: 結晶構造と生物物理学的特性。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 189、4881–4889 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブラウン、J.ら。真菌のβ-グルカン結合免疫受容体デクチン-1の構造: 機能への影響。タンパク質科学。 16、1042–1052 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanek, O. et al. ラットナチュラルキラー細胞の組換え可溶性二量体C型レクチン様受容体の作製。科学。議員9号、17836号（2019年）。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

ブラハ、J. et al. HEK293S GnTI- 細胞における可溶型のヒトナチュラルキラー細胞受容体 NKR-P1 の高レベル発現と精製。タンパク質指数プリフ。 140、36–43 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ローザー、S. et al. ヒト KLRB1 遺伝子の c.503T>C 多型は、CD161 分子のリガンド結合と阻害能を変化させます。 PLoS One 10、e0135682 (2015)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Skorepa, O. et al. ナチュラルキラー細胞活性化受容体 NKp30 オリゴマー化はその N-グリコシル化に依存します。キャンサーズ 12、1998 (2020)。

論文 CAS PubMed Central Google Scholar

デービス、DM et al. 人間のナチュラルキラー細胞の免疫シナプス。手順国立アカデミー。科学。 USA 96、15062–15067 (1999)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pageon、SV et al. 超解像度顕微鏡により、NKG2Dの活性化による抑制性ナチュラルキラー細胞受容体のナノメートルスケールの再構成が明らかになりました。科学。信号。 6、ra62 (2013)。

論文 PubMed CAS Google Scholar

スタンパー、CC 他ヒトの免疫応答を阻害する B7-1/CTLA-4 複合体の結晶構造。 Nature 410、608–611 (2001)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Schwartz, JC、Zhang, X.、Fedorov, AA、Nathenson, SG & Almo, SC ヒト CTLA-4/B7-2 複合体による共刺激の構造基盤。 Nature 410、604–608 (2001)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Bhatia, S.、Sun, K.、Almo, SC、Nathenson, SG & Hodes, RJ B7-1 二量体と単量体の動的平衡は、TCR/CD28 刺激に応答した免疫学的シナプス形成と T 細胞活性化に異なった影響を与えます。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 184、1821–1828 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Reeves, PJ、Callewaert, N.、Contreras, R. & Khorana, HG ロドプシンの構造と機能: テトラサイクリン誘導性 N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ I 陰性 HEK293S 安定哺乳動物による、制限された均質な N-グリコシル化を伴うロドプシンの高レベル発現細胞株。手順国立アカデミー。科学。 USA 99、13419–13424 (2002)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grueninger-Leitch, F.、D'Arcy, A.、D'Arcy, B. & Chene, C. 組換え融合タンパク質グリコシダーゼを使用した結晶化のためのタンパク質の脱グリコシル化。タンパク質科学。 5、2617–2622 (1996)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カブシュ、W. Xds. アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 66、125–132 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

エバンス氏、広報、ムルシュドフ氏、GN 私のデータはどの程度優れていますか? 解像度はどれくらいですか? アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 69、1204–1214 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Long, F.、Vagin, AA、Young, P. & Murshudov, GN BALBES: 分子置換パイプライン。アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 64、125–132 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、Ｙら。 E-カドヘリンに結合したナチュラルキラー細胞受容体KLRG1の構造は、MHCに依存しない自己認識欠落の根拠を明らかにする。免疫 31、35–46 (2009)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

マッコイ、AJ 他フェイザー結晶解析ソフトウェア。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 40、658–674 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コレンコ、P. et al. マウス活性化NKR-P1受容体の分子構造。Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．バイオル。 175、434–441 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vagin, A. & Teplyakov, A. MOLREP による分子置換。アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 66、22–25 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ムルシュドフ、GN 他高分子結晶構造の微細化のための REFMAC5。アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 67、355–367 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P.、Lohkamp, B.、Scott, WG & Cowtan, K. オオバンの特徴と開発。アクタクリスタログル。Ｄ．Ｂｉｏｌ．クリスタロガー。 66、486–501 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロズベスキー、D. et al. 大腸菌における可溶型マウスナチュラルキラー細胞受容体NKR-P1C(B6)の高レベル発現。プロット。 Expr. プリフ。改訂 77、178–184 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Schuck, P. 沈降速度超遠心分離とラム方程式モデリングによる巨大分子のサイズ分布分析。生物物理学。 J. 78、1606–1619 (2000)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カリフォルニア州ブローティガム分析用超遠心分離データの計算と出版品質のイラスト。メス。酵素モール。 562、109–133 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Schuck、P. 沈降速度分析超遠心分離によるタンパク質の自己会合の分析について。アナル。生化学。 320、104–124 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Scheuermann, TH、Padrick, SB、Gardner, KH & Brautigam, CA マイクロスケール熱泳動データの取得と分析について。アナル。生化学。 496、79–93 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ペトウホフ、MV 他小角散乱データ解析用のプログラムパッケージを新たに開発。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 45、342–350 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Konarev、PV、Volkov、VV、Skolova、AV、Koch、MHJ & Svergun、DI PRIMUS: 小角散乱データ解析用の Windows PC ベースのシステム。Ｊ．Ａｐｐｌ．クリスタロガー。 36、1277–1282 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Li、Z.、Michael、IP、Zhou、D.、Nagy、A.、Rini、JM 誘導性タンパク質生産のためのシンプルな piggyBac トランスポゾンベースの哺乳動物細胞発現システム。手順国立アカデミー。科学。 USA 110、5004–5009 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ovesny, M.、Krizek, P.、Borkovec, J.、Svindrych, Z. & Hagen, GM ThunderSTORM: PALM および STORM データ分析および超解像度イメージングのための包括的な ImageJ プラグイン。バイオインフォマティクス 30、2389–2390 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カリフォルニア州シュナイダー、WS州ラズバンド、KWエリセイリ NIH Image to ImageJ: 25年にわたる画像解析。ナット。メソッド 9、671–675 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thompson, RE、Larson, DR & Webb, WW 個々の蛍光プローブの正確なナノメートル位置分析。生物物理学。 J. 82、2775–2783 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andronov, L.、Orlov, I.、Lutz, Y.、Vonesch, JL & Klaholz, BP ClusterViSu、超解像度顕微鏡におけるボロノイテッセレーションによるタンパク質複合体のクラスター化方法。科学。議員 6、24084 (2016)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブラハ、J.ら。ヒト NKR-P1:LLT1 SEC-SAXS 生データ。 Mendeley データ、V1、https://data.mendeley.com/datasets/268ww2m4j3/1 (2022)。

SC ラベルら。 Calpha 幾何学による構造検証: phi、psi、Cbeta 偏差。プロテイン 50、437–450 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マデイラ、F. et al. 2022 年に EMBL-EBI から検索および配列分析ツールサービスが提供されます。Nucleic Acids Res. 50、W276–W279 (2022)。

論文 PubMed Central Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. 新しい ENDscript サーバーを使用してタンパク質構造の主要な特徴を解読します。核酸研究所 42、W320–W324 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、チェコ科学財団からOVへの助成金15-15181 Sおよび18-10687 S、チェコ共和国教育・青少年・スポーツ省からOVへの助成金LTC17065（COSTアクションCA15126 MOBIEUの枠内）、カレル大学助成機関は、JB および BK、および欧州地域開発基金 (CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000447) にプロジェクト 161216 および 1378219 を割り当てています。顕微鏡検査は、欧州地域開発基金とチェコ共和国の国家予算との協調融資を受けて、共焦点蛍光顕微鏡研究所で実施されました（プロジェクト番号 CZ.1.05/4.1.00/16.0347 および CZ.2.16/3.1.00）。 /21515)、チェコのバイオイメージング大規模 RI プロジェクト LM2018129 によってサポートされています。計算リソースは、大規模研究開発インフラストラクチャプログラム内で提供されるプロジェクト「e-Infrastruktura CZ」(e-INFRA LM2018140) によって提供されました。 MEYS CR (LM2018127) によってサポートされる、CMS、CIISB、Instruct-CZ Centre の CF 生物物理学的手法の使用を認めます。著者らは、原稿を批判的に校正してくれたカルロス V. メロ博士に感謝したいと思います。著者らはまた、OV および JB に対する研究開発パイロットスキーム APPID 56 および 286 を通じた Instruct-ERIC のサポートとリソースの使用、および BioStruct-X EC FP7 プロジェクト 283570 のサポートとリソースの使用を認めます。ウェルカムセンターフォーヒューマンジェネティクスは、ウェルカムトラスト (認可 090532/Z/09/Z)。ビームタイム（提案MX10627）を提供してくれたダイヤモンド光源と、データ収集を支援してくれたビームラインI03と21のスタッフに感謝します。

ヤン・ブラハ

現在の住所: EMBL, Hamburg Unit c/o DESY, Notkestrasse 85, 22607, Hamburg, Germany

バルボラ・カロウスコバ

現在の住所: 応用物理研究所 – 生物物理グループ、TU Wien、Getreidemarkt 9、1060、ウィーン、オーストリア

デニス・クント

現在の住所：ローザンヌ大学ルートヴィッヒ癌研究所腫瘍学部、Chemin des Boveresses 155, 1066, Epalinges, Switzerland

サミュエル・パジッキー

現在の住所: School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Nanyang Drive 60, 637551, Singapore, Singapore

カレル大学理学部生化学部、Hlavova 2030、12800、プラハ、チェコ共和国

ヤン・ブラハ、バルボラ・カロシュコヴァ、オンドジェ・スコジェパ、デニス・クムント、サミュエル・パジツキー、エディタ・ポラホバ、セレステ・アブレウ、オンドジェ・ヴァニェク

バイオテクノロジー研究所、チェコ科学アカデミー、BIOCEV Centre、Průmyslova 595、25250、Vestec、チェコ共和国

テレザ・スカーロヴァ、ヤン・ストランスキー、トマーシュ・コヴァチ、ヤルミラ・ドゥシュコヴァ、ジンドジフ・ハシェク、ヤン・ドナーレク

カレル大学理学部細胞生物学部、Viničná 7、12800、プラハ、チェコ共和国

ヴァレリア・グロバロバ

オックスフォード大学ウェルカム人類遺伝学センター構造生物学部門、Roosevelt Drive、OX3 7BN、オックスフォード、英国

チャオ・ユーグアン & カール・ハーロス

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

JB、OS、BK、SP、EP、および CA はタンパク質の発現と精製に貢献しました。 JB と YZ はタンパク質の結晶化を実行しました。 YZ と KH は X 線回折測定を実施しました。 JB、TS、JS、TK、J.Du.、J.Do。データ処理とモデルの改良に貢献しました。 OS は SEC-SAXS データ測定を実行しました。 JB と TS は SAXS データ分析を実行しました。 OV は分析用超遠心分離測定と分析を実施しました。 JB と BK は dSTORM データを取得して分析しました。 BK、VG、および DC は NK 細胞毒性アッセイを実施しました。 JB、TS、J.Do.、OV が実験を設計し、JH からの重要な意見を取り入れて原稿を書きました

オンドジェ・ヴァニェクへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Bláha, J.、Skálova, T.、Kalousková, B. 他ヒト NK 細胞 NKR-P1:LLT1 受容体:リガンド複合体の構造は、免疫シナプスにおけるクラスター化を明らかにします。 Nat Commun 13、5022 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

引用をダウンロード

受信日: 2021 年 11 月 6 日

受理日: 2022 年 8 月 5 日

公開日: 2022 年 8 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32577-6

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

ニュース