アロ倍数化の包括的なトランスクリプトーム解析により、

Communications Biology volume 6、記事番号: 426 (2023) この記事を引用

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4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

合成六倍体小麦 (SHW) 系統は、六倍体小麦の D サブゲノムを多様化し、Aegilops tauschii 遺伝子プールの未開発の遺伝的多様性を活用するための育種前の生殖質として作成されます。ただし、Ae で観察される表現型。おそらくサブゲノム間の相互作用のため、タウスキーの親は SHW 系統で常に回収されるわけではありません。この倍数体化後のゲノム再プログラミング現象を解明するために、10 の組織と 3 つの生物学的複製にわたって、4 つの SHW 系統とそれらの対応する 4 倍体および 2 倍体の親の RNA 配列決定を実行しました。 18,000を超えるトライアドを使用したホモエオログ発現バイアス（HEB）分析は、SHWにおけるDサブゲノムのホモ対立遺伝子の大規模な抑制を示唆しています。全ゲノム遺伝子セットの比較トランスクリプトーム分析により、この発見がさらに裏付けられました。高信頼性遺伝子の選択的スプライシング解析では、5 つのスプライスイベントすべてが特定され、保持されたイントロンが優勢であるというさらなる複雑さの層が示されています。六倍体コムギの再合成時のホモエログ発現は、倍数化の際のサブゲノム間のエピスタティック相互作用の効果の捕捉に関連するため、育種におけるこの生殖質の使用および取り扱いに影響を及ぼします。遺伝子発現におけるサブゲノム間相互作用の範囲と作物改良のための形質への影響を考慮するには、育種前の活動においてこの生殖質に特別な考慮を払う必要があります。

全ゲノム重複イベントは、種分化の主要な推進要因の 1 つです1、2、3。被子植物の大部分は進化の過程で倍数化を経験しており、特に、ゲノム内の重複遺伝子座の程度に基づいて作物種の 30% が倍数体であると考えられています 4。イネ科の系統は少なくとも 3 回の全ゲノム重複事象を経験し 5、基本的にイネ科全体が倍数体になりました。全ゲノム重複事象は、変化する環境への適応を促進する重要な進化の可能性と関連していることが頻繁に見出されています6,7。倍数体に関しては、安定化のためにゲノム内で受ける初期の動的変化から、離散集団としての確立に至るまで、いくつかの興味深い疑問が存在します8。倍数化はゲノム内に広範な冗長性を生み出し、それによって新しい表現型の発達や適応を促進する新しい変化への道を開きます9。

パン小麦 (Triticum aestivum L.) は、A、B、D サブゲノムで構成される異種六倍体作物 (2n = 6x = 42) です。約8000年前に栽培エンマー小麦（Triticum turgidum L. ssp. dicoccum、2n = 4x = 28; AABBゲノム）とタウシュヤギグラス（Aegilops tauschii Coss.、2n = 2x = 14; DDゲノム）の間で起こった自然な偶然の交雑、その後の染色体の倍加により、現代のパン用小麦が開発されました10,11。おそらく、限られた数のAeのみが存在する。タウスキー植物は六倍体小麦の進化に貢献し、創始者効果と呼ばれる進化のボトルネックを引き起こしました12。このボトルネックは、二倍体種から六倍体種への遺伝的変異の自然な流れが限られていて 13,14 、その後の家畜化と繁殖によってさらに狭められていました。

作物種の野生近縁種は、農業上重要な複数の形質の遺伝的多様性の源となっています。ただし、その使用には、結合薬物、不妊症、および低い相互適合性など、特定の制限があります15。事前育種は、作物の野生近縁種の遺伝的多様性を取り戻し、それを育種プログラムに導入することを目的とした体系的なアプローチです。伝統的に、野生作物種からの目的のゲノムセグメントは、前景と背景の選択のための最先端の全ゲノムジェノタイピングツールのサポートを受けて戻し交配を繰り返すことによって、エリート品種のバックグラウンドに遺伝子移入されます。 T. turgidum ssp.とT. turgidum ssp.の間の人工ハイブリダイゼーションから生成されたSHW。デュラム（AABB）または他の亜種およびAe。 tauschii (DD) は染色体倍加を経て、6 倍体コムギの D サブゲノムの遺伝的多様性を広げる効果的な育種前集団として機能します。国際トウモロコシ小麦改良センター (CIMMYT、メキシコ) によって開発された SHW は、いくつかの国で小麦の遺伝的多様性強化プログラムに広く利用されています。その後、世界中の他の研究機関や小麦改良プログラムでも、さまざまなAe源を使用してSHWが生産されました。商業小麦育種の基本集団として機能する tauschii の登録。

ああ。タウスキーは、広範囲の生物的および非生物的ストレスに対する耐性の源であることが証明されています18。しかし、親の表現型が合成六倍体株で常に効果的に回復するとは限りません。これはおそらく、動的な遺伝的およびエピジェネティックな変化と、その結果として生じる遺伝子発現の変動によるものと考えられます 19。例えば、過去 20 年にわたる研究では、茎さび病原体 (Puccinia graminis f. sp. tritici) に対する耐性が、6 倍体状態では D サブゲノムによってコードされるメディエーター複合体の構成要素である Med15 によって抑制されることが示されています 20,21。倍数化すると、高親和性 K + トランスポーター 1;5 (HKT1;5) の D ホモエオログは、二倍体の親レベルと比較した場合、発現の低下を示しますが、塩ストレス条件下では二倍体の親の天然発現レベルを回復します 22。粒幅などの特定の表現型では、各ホモエオログは目的の形質と異なる形で関連付けられており、それらの組み合わせた発現レベルによって結果として得られる表現型が決まります23。

倍数化の際の遺伝子制御の複数の層にわたる変化も、親の四倍体および二倍体と比較した場合、異六倍体パンコムギの適応性を向上させると考えられています 24,25。小麦の倍数化時に報告されている遺伝的およびエピジェネティックな変化は、他の倍数体植物種と同様です。構造レベルでは、ゲノム間の同種交換とは別に、認識されたゲノムストレスによる反復 DNA の損失と増幅の両方が観察されています 26。最近のパン小麦の全ゲノム配列決定により、A、B、D サブゲノムの遺伝子間領域におけるトランスポゾンの挿入と欠失が明らかになりましたが、同種ゲノム間の各トランスポゾンファミリーの割合は大きく異なりません 27。エピジェネティックレベルでは、DNA のシトシンメチル化状態の変化、ヒストンメチル化の変動 28,29、染色体間のユークロマチンとヘテロクロマチンのパターン、および低分子 RNA などのエピジェネティック調節因子のレベルの顕著な差異も観察されました 30,31。ゲノムの調節要素上のこれらのエピジェネティックなマークは、六倍体パンコムギの遺伝子発現レベルを調節します32。

倍数化の際に生じるこれらのゲノムおよびエピゲノム変化の一部の影響は、トランスクリプトームに反映されます。親の倍数性背景と六倍体コムギの間の発現変化のパターンを理解することは、種間交配に情報を提供し、子孫で回復する表現型の予測に役立つ貴重な情報を提供します。この研究では、トランスクリプトームダイナミクスの比較評価のために、4 つの SHW 系統とそれらの対応する 4 倍体 (T. turgidum) および 2 倍体 (Ae. tauschii) の親を使用しました。私たちは、親 (2x および 4x) と合成ハイブリッドバックグラウンド (6x) のサブゲノム間の同種遺伝子の発現パターンの変化を解明することに焦点を当てました。量的な違いに加えて、選択的スプライシング事象から生じる転写産物の微妙な質的な違いも決定されました。

この実験では、RNA-seq データは、4 つの SHW 系統とその 2 つの二倍体および 2 つの四倍体の親 (補足表 1)、合計 240 サンプルの 10 組織にわたる 3 つの生物学的複製 (補足図 1) から生成されました。 240 サンプルのシーケンシングリードの前処理後、合計 4.9 B リードが得られました。これは、サンプルあたり平均 2040 万リード (480 万から 7070 万リード) に相当します。各サンプルの生リード数と処理リード数がまとめられました（補足表 2、3）。総リードの約 85% は Chinese Spring IWGSC RefSeq v2.133 に一意にマッピングされ、約 12% は複数の遺伝子座にマッピングされ、約 3% はまったくマッピングされませんでした (補足表 4)。

倍数化、特に HEB における遺伝子発現動態の全体的なパターンを理解し、SHW とその親状態の間でそれらを比較するために、トライアドに属する遺伝子 (ホモエオログ)、つまり 3 つすべてのサブゲノム (18,357 トライアド 34) に 1 つのコピーを持つ遺伝子 (ホモエオログ) を比較します。 )、尤度比検定 35 (LRT) 計算を行いました。ここで、ホモオログ間の遺伝子長の違いを考慮します。帰無仮説、すなわちホモエオログ間に発現差がないことをすべての比較について検定した。 SHW 系統では、AB 対 D 相同体が比較されました。親の発現状態をテストするために、対応する 4 倍体および 2 倍体の親の発現レベルを備えたインシリコ SHW のようなシナリオが構成されました。親の発現レベルにおいて主に D サブゲノムに向かう発現バイアスが、10 組織すべておよび SHW にわたって観察されました (図 1)。二倍体（D）親によって寄与されたサブゲノムに対する重大な偏りを示すトライアドの数は、すべての組織にわたる対応するSHW系統で大幅に減少しました（図1および補足表5）。葯が緑色で未熟なときの雌しべ組織には、4 つすべての SHW の親の発現レベルに基づいて、D サブゲノムに偏った 10,000 個を超えるトライアドがありました。ブート段階で収集されたヘッドは、C44 を除くすべての SHW で同様のパターンを示しました (図 1)。

紺色および濃いオレンジ色のバーは、それぞれ AB および D サブゲノムに対する有意な発現偏りを示すトライアドの数を表します。 Pistil-1DAA 雌しべ - 開花 1 日後、Pistil-AM 雌しべ - 葯が成熟段階にあるとき、Pistil-AI 雌しべ - 葯が未熟段階にあるとき、ブーツヘッドはブーツ段階にあります。

SHW-C66 の苗条組織では、9978 および 808 トライアドは、親の発現レベルに基づいて、それぞれ D サブゲノムおよび AB サブゲノムに対する有意な偏りを示しました。しかし、SHWバックグラウンドでは、890個のトライアドのみがDサブゲノムに偏っていました（図2a、b）。葯では、5667および1115のトライアドは、前駆細胞の発現レベルでそれぞれDおよびABサブゲノムに偏っており、1740個のD偏ったトライアドおよび1841個のAB偏ったトライアドを含む六倍体条件ではよりバランスが取れていました（図2c、d）。同様に、親の発現レベルでDサブゲノムに偏った10,128個のトライアドは、SHWの雌しべ（葯が緑色で未熟なときに収集）では2976個に減少しました（図2e、f）。これらの結果は、相互作用がないシナリオ、つまり親の発現状態と、サブゲノムの相互作用によって引き起こされる大規模な遺伝子発現変化、つまりSHW株の間で、数百の遺伝子セット間での発現偏りの大きな変化を示しています。 D サブゲノムに著しく偏ったトライアドの数は、合成六倍体バックグラウンドに遺伝子移入された場合の発現と比較して、親ゲノムバックグラウンドでより高かった。 SHW-C66の他の7つの組織のHEBの分布を補足図に示します。 2～8。

(a、c、e) 四倍体 (PI377655) および二倍体 (AS2386) 親の AB ゲノムおよび D ゲノムに対する三徴の発現バイアスの比較。 (b、d、f) SHW-C66 の AB および D サブゲノムに対するトライアドの発現バイアスの比較。 (a、b) シュートする。 (c、d) 裂開直前の成熟した葯。 (e, f) 葯が緑色で未熟なときの雌しべ。紺色および濃いオレンジ色のバーは、それぞれ AB および D サブゲノムに対する有意な発現偏りを示すトライアドを表します。

相互作用がないと予測されたインシリコシナリオでは、SHW-C45 のシュート組織で観察されたように、D ゲノムに偏ったトライアドの割合は、AB ゲノムに偏ったトライアドの割合より少なくとも 1.5 倍 (LogFC 0.6) 高かった。 SHW-C66のブーツ段階の頭部組織で観察されたように、最大27倍（LogFC 4.8）高くなります（図3）。しかし、この数は実際の六倍体バックグラウンドでは大幅に減少し、ほぼ同数のトライアドが両方の親 (AB および D) のサブゲノムに偏っていました。逆に、反対方向の発現偏り、すなわちABゲノムに偏ったトライアドは、SHWのほとんどの組織で増加し、最も顕著なHEBがSHW株C44で観察されました（図3）。

比率は対数倍数変化 (LogFC) 値として表されます。 LogFC < 0 は、ゲノム背景内で、より多くのトライアドが D サブゲノムよりも AB サブゲノムに偏っていることを示し、LogFC > 0 は、より多くのトライアドが AB サブゲノムよりも D サブゲノムに偏っていることを示します。 C44、C45、C65、および C66 は、研究のために採取された 4 つの SHW です。緑色のバーは親のゲノムバックグラウンドの比率を表し、青色のバーは SHW ゲノムバックグラウンドを表します。 Pistil-1DAA 雌しべ - 開花 1 日後、Pistil-AM 雌しべ - 葯が成熟期、Pistil-AI 雌しべ - 葯が未熟期、ブーツヘッド（ブーツ期）。

同じサブゲノム背景内の傾向の分析により、親状態と比較して、AB サブゲノムに偏ったトライアドが六倍体状態でより多数であることが明らかになりました (図 4)。 SHW-C44 のすべての組織では、AB サブゲノムへの発現偏りを示すトライアドの割合が増加し、胚軸組織では最大 7.9 倍 (LogFC 2.98) 多くのトライアドが過剰発現されました。他の 3 つの SHW 系統では、AB サブゲノムに偏ったトライアドの増加は最大 5.2 倍でした (C66 のブート段階の頭部、LogFC 2.37)。 D サブゲノムに偏ったトライアドの割合は、複数の SHW 組織コンテキストにわたって検出された場合の 8 分の 1 以上減少しました。

比率は対数倍率変化 (LogFC) 値として表示されます。 LogFC > 0 は、親のバックグラウンドよりも SHW バックグラウンドの AB サブゲノムに向かってより多くのトライアドが偏っていることを示し、LogFC < 0 は、D サブゲノムの場合と同様に、SHW よりも親のバックグラウンドで AB サブゲノムに向かってより多くのトライアドが偏っていることを示します。 C44、C45、C65、および C66 は、研究に使用された 4 つの SHW です。紺色および濃いオレンジ色のバーは、それぞれ AB および D サブゲノムに対する有意な発現偏りを示すトライアドを表します。 Pistil-1DAA 雌しべ - 開花 1 日後、Pistil-AM 雌しべ - 葯が成熟期、Pistil-AI 雌しべ - 葯が未熟期、ブーツヘッド（ブーツ期）。

SHW および親の背景シナリオの AB および D バイアストライアドの HEB 値の平均の大きさを補足表 5 にまとめます。 AB バイアストライアドの場合、HEB 値の大きさは -1.17 (C65 - 葯があるときの雌しべ) の範囲でした。緑色および未熟）から-4.37（C44-胚軸）、SHWバックグラウンドで。 AB バイアストライアドの HEB の大きさは、親の背景で -1.22 (C65 - ブート段階の頭部) から -3.56 (C66 - ブート段階の頭部) まで変化しました。同様に、D バイアストライアドの HEB 値の大きさは、SHW バックグラウンドでは 1.16 (C44 - 葯が緑色で未熟なときの雌しべ) から 3.12 (C45 - 艶) まで、および 1.32 (C45 - ブート段階の頭部) に広がりました。親の背景で、4.66 (C45 - シュート) まで。 AB バイアストライアドの HEB 値の平均値は、葯が緑色で未熟な雌しべの C65 SHW バックグラウンドを除いて、すべての SHW 組織シナリオにわたって D バイアストライアドの HEB 値よりも高かった。ただし、親の背景には固定パターンは観察されませんでした (補足表 5)。

異なる SHW 系統にわたって同様の発現バイアスパターンを示すトライアドのサブセットも分析されました。 4つのSHW系統間の交点、および共通の4倍体または2倍体の親を共有するSHW系統間の交点をシュート組織に関して図5に示す。最大の交差は、4つのSHW系統すべてで有意な偏りを示さないサブセットを表し、これは10の組織すべてにわたって当てはまりました（図5、補足図9〜17）。シュート組織は、4 つの SHW 系統にわたって、AB (228 トライアド) および D (242 トライアド) サブゲノムに対する同様の有意な発現偏りを示すトライアドの最小サブセットを持っていました (図 5)。 SHW 系統間の最大の交差点は、葯が緑色で未熟なときの雌しべ (補足図 15) と、AB 偏り (1281) と D 偏り (1066) のトライアドの開花 1 日後の雌しべで見つかりました (補足図9)。

C44AB に対応する設定サイズの下の灰色の水平バーは、SHW-C44 の AB サブゲノムに偏ったトライアドの数を示します。 C44D は、SHW-C44 内の D サブゲノムに偏ったトライアドの数を示します。 C44UN は、SHW-C44 で顕著な偏りを示さないトライアドの数を示します。同様に、SHW C45、C65、および C66 についても同様です。交差サイズの下の垂直バーは、セット間で同様の発現パターンを示すトライアドの数を示します。黒い点は、対応する交差点で比較された 2 つの SHW セットを強調表示します。バーの上の数字は、同様の発現パターンを示すトライアドの数を表します。 AB または D サブゲノムに対する有意な偏りを示すトライアドセットと、有意な偏りを示さないトライアドセットは、それぞれ青、緑、茶色の長方形で強調表示されます。

発現パターンについて分析された18,357のトライアドのうち、69％から73％は、4つのSHW系統すべてにおいて、組織特異的なホモエオログをまったく含んでいませんでした（補足表6）。次に大きな画分は、3 つすべてのホモエオログが同じ組織特異的発現を示すトライアド (8% ～ 11%) と、1 つのホモエオログのみが組織特異性を示し、他の 2 つがより広範囲に発現しているトライアド (7% ～ 12%) でした。さらに、別の組織で発現特異性を示す 1 つのホモオログ単独よりも、同じ組織に対して発現特異性を示す 2 つのホモオログと広く発現する 1 つのホモオログを含むトライアドの方が多かった (補足表 6)。

同様の構成が個々の SHW 組織状況で観察され、最も一般的には 3 つのホモオログのうち 1 つだけが組織特異的であるか、3 つのホモオログすべてが組織特異性を示しました (補足表 7)。組織特異性を示す 3 つのホモオログのうち 2 つだけを含むトライアドは、4 つの SHW 系統すべての 10 の組織の中で数が最も低かった。根および成熟葯組織では、組織特異性を示すすべてのホモエオログから構成されるトライアドのサブセットが、4 つの SHW 系統すべてで最大でした。 3 つすべてのホモエオログが同じ組織特異性を示すトライアドのより大きなサブセットのうち、根の 455 のトライアドが 4 つの SHW 系統すべてで共通でした。これらの三つ組のホモエオログを機能強化を理解するために遺伝子オントロジー解析に供したところ、根の形態形成の制御や根分裂組織の成長制御などの生物学的プロセスの用語が根で強化されました。成熟した葯では、この数は 427 であり、花粉の発芽、花粉精細胞の分化、花粉管の成長、花粉壁の構築などの生物学的プロセスの用語が豊富でした。

1、2、または 3 つの組織特異的ホモオログから構成される多数のトライアドは、トライアドデータセット全体での観察と同様に、有意な発現偏りを示さなかった。 AB および D- バイアスを示すトライアドとその組織特異性パターンを具体的に調べたところ、ほぼすべての組織で、バイアスパターンとホモオログの組織特異性の間に、0.20 ～ 0.57 の範囲の Cramer's-V 統計量との中程度の強さの関連性が観察されました。 SHW ラインが 4 つあります。例えば、D-ホモエオログのみが組織特異的である場合には、より多くのトライアドがD-サブゲノムの偏りを示し、AおよびBホモログが組織特異性を示す場合には、より多くのABに偏ったトライアドが観察され、AおよびDの場合には、より多くのD-偏ったトライアドが観察される。または、ほとんどの SHW 組織状況において、B および D ホモエオログのみが組織特異性を示しました。しかし、独立性のカイ二乗検定に基づくと、発現偏りと組織特異性の間の関連性は、4 つの SHW 系統すべての成熟葯、根、および胚軸組織でのみ有意であり、C66 は開花 1 日後の雌しべでもさらに有意な関連性を示しました。雌しべ - 葯が緑色で未熟なとき、C44 はすべての組織で有意な関連性を示しました。観察された関連性の程度は中程度であったが、同性愛者の組織特異性と発現バイアスとの関係を無視することはできない。

より安定化したゲノムで観察されたパターンを検証するために、Ramírez-Gonzalezらの在来種チャイニーズスプリングと品種アズルナヤの公的に入手可能なRNA-seqデータを使用して、栽培化および育種プロセスを受けた小麦系統の発現偏りを分析した。 36. HEB の数と発現バイアスの大きさは、SHW 系統と比較して、これらの遺伝子型でははるかに小さかった (図 6)。図6に報告されている組織では、アズフルナヤでは、2087～4244個のトライアドがABサブゲノムに偏り、2032～3739個のトライアドがDサブゲノムに偏っていました。チャイニーズ・スプリングでは、874～4512個のトライアドがABサブゲノムに偏り、812～3739個のトライアドがABサブゲノムに偏っていました。分析に使用された 5 つの組織全体で、3821 のトライアドが D サブゲノムに偏っていました。バイアスの大きさは、新たに作出された SHW 系統と比較して、2 つの栽培小麦系統の方が低かった。

比率は、青いバーで示される対数倍率変化 (LogFC) 値として表されます。 LogFC < 0 は、より多くのトライアドが D サブゲノムよりも AB サブゲノムに偏っていることを示し、LogFC > 0 は、より多くのトライアドが AB サブゲノムよりも D サブゲノムに偏っていることを示します。

SHW、チャイニーズスプリング、アズルナヤの結果を用いて、三つ組のHEBパターンに対する家畜化と繁殖過程の影響を分析した。私たちの SHW 組織のうち 3 つは、Ramírez-Gonzalez et al.36 のサンプルの発育段階、つまり葯が成熟したときの雌しべ、ブーツ段階の根と頭と一致する可能性があり、この分析に使用されました。トライアドの大部分（29〜55％）は、3つの組織すべてで、再合成小麦、在来種（チャイニーズスプリング）、および品種（アズルナヤ）で同様の発現バイアスパターンを維持しました（補足図18）。 SHW と Chinese Spring では同様のバイアスパターンを示したのは 9 ～ 14% だけでしたが、Azhurnaya では異なるバイアス状態に移行しました。これはおそらく厳密な選択の影響を反映していると考えられます。さらに、さまざまなSHW組織シナリオに基づいて、トライアドの9〜30％が、アズルナヤにおけるSHWバイアス状態への逆転を示しました（補足図18）。 SHW ライン間のトライアドの HEB の違いを考慮して、4 つの SHW ラインすべてにわたって同様のバイアスパターンを示すトライアドのサブセットも特に調査しました。このサブセットのトライアドの大部分は、SHW、チャイニーズ・スプリング、およびアズルナヤで同じ発現バイアス・パターンを保持し、2番目に大きい割合は、SHWとアズルナヤで同様のパターンを示したが、チャイニーズ・スプリングでは示されず、収穫中のバイアス・パターンの逆転を示しています。改善。 Chinese Spring と Azhurnaya を含む同様のパターン変化を示すトライアドセットが最小でした。

10 の異なる組織にわたる HEB 発現分析により、組織全体、つまり発生段階にわたるトライアドのバイアスパターンの調査が可能になりました。 4 つの SHW 系統すべてで、観察された最大のパターンはトライアドであり、どの組織にも大きな偏りはありませんでした。 SHW 系統には、このパターンを示す 1449 から 3014 のトライアドが存在しました (図 7、補足図 19)。 4つのSHW系統すべてで、次に最も一般的に観察された偏り傾向は、トライアドがどの組織でも有意な偏りを示さなかったが、成熟葯組織のみでABまたはDサブゲノムに偏っていた場合でした（図7、補足図。 19）。雌しべ（開花後 1 日後、葯が緑色で未熟な雌しべ、根元）などの組織の 1 つに重大な偏りのみを示すパターンが、複数の三つ組で観察されました。さらに、組織全体に何千ものトライアド固有のパターンがありました。同様の傾向がアズルナヤでも観察され、葯組織で有意な偏りを示すトライアドのサブセットがより大きかったのに対し、チャイニーズ・スプリングでは穂組織のみで有意な偏りを示すトライアドが一般的でした。

(a) SHW-C66、(b) 在来種チャイニーズスプリング、(c) 品種アズルナヤの組織全体にわたるトライアドの発現バイアス傾向を表す沖積プロット。 AB バイアス (AB)、紺色のバーで表されます: AB サブゲノムに向かって著しく偏ったトライアド。 D バイアス (D)、濃いオレンジ色のバーで表されます: D サブゲノムに向かって著しく偏ったトライアド。発現なし (NE)、緑色のバーで表示: トライアドのホモエオログは発現されていません。不偏 (UN)、灰色のバーで表示: 有意な発現偏りは観察されません。

さらに、親と SHW の間の全遺伝子セットの差次的発現解析が調査されました。 IWGSC RefSeq アノテーション v2.133 に従って六倍体小麦ゲノムで同定された 106,913 個の高信頼遺伝子モデルが分析に使用されました。 AおよびBサブゲノムの遺伝子において、SHW-C44の四倍体親と比較して、SHWではわずか数百から最大1015の遺伝子が下方制御されていた（図8）。対照的に、20,000を超えるDサブゲノム遺伝子が、それらの二倍体の親と比較して、すべてのSHWにおいて下方制御されていた(図8)。最も重要なことは、3 つのサブゲノムすべてにおいて、AB サブゲノムでは 357 ～ 755 遺伝子、D サブゲノムでは 141 ～ 372 遺伝子のみが六倍体状態で上方制御を示したことです。

青色のバーは下方制御された遺伝子の数を表し、黄色のバーは上方制御された遺伝子の数を表します。

RNA-seq データもマイニングされ、さまざまな倍数性レベルでのスプライシングパターンの違いを特徴づけ、転写産物間の定性的な違いを明らかにしました。この分析により、差次的に発現されるかどうかにかかわらず、すべての遺伝子のスプライスバリアントが捕捉されました。 5 つの主要なタイプの選択的スプライシングイベント、すなわち相互排他的エクソン (MXE)、選択的 3' スプライシングサイト (A3SS)、選択的 5' スプライシングサイト (A5SS)、保持されたイントロン (RI)、およびスキップされたエクソン (SE) が調査されました (図 1)。 9)。例として、各遺伝子型で検出された統計的に有意な選択的スプライシング RNA アイソフォームの数が、積み上げ棒グラフのファセット内の苗条組織について示されています (図 10a、b)。保持されたイントロンは最も一般的な選択的スプライシングイベント (34.2 ～ 79.5%) であり、相互に排他的なエクソンはすべてのシナリオで最も検出されませんでした (0 ～ 7.3%)。成熟した葯と雌しべ（葯が緑色で未熟なとき）では、他の組織と比較して選択的スプライス現象が最も少なくなりました。他の9つの組織で検出された選択的スプライスイベントの数を補足図に示します。 20〜28。検出された複数の選択的スプライシングイベントのうち、69％〜78％がトライアドの同種遺伝子に対応しました（図10cおよび補足図20〜28）。すべての比較において、より多くの選択的スプライシング事象がDホモエオログと関連していた。ただし、C45対親の苗条組織を除き、同じ割合の事象が3つすべてのサブゲノムと関連していた（図10cおよび補足図20〜28）。全体として、同種発現バイアスによって測定されるように、SHW 系統では D サブゲノムの大規模な量的抑制が観察され、選択的 RNA スプライシングイベントのより大きな表現によって示されるように、このサブゲノムでは質的変化もより顕著でした。

(a) 代替 3' スプライシング部位。 (b) 代替 5' スプライシング部位。 (c) 相互に排他的なエクソン。 (d) 保持されたイントロン。 (e) スキップされたエクソン。赤いプロットは Ae を表します。 tauschii C26 親転写物、黄色のプロットは SHW 系統 C66 転写物を表します。

(a) 二倍体の親と SHW 系統。 (b) 四倍体の親と SHW。 MXE 相互排他的エクソン、A3SS 選択的 3 ' スプライシング、A5SS 選択的 5' スプライシング、RI 保持イントロン、SE スキップエクソン、LA ラングドン、PI PI377655; (c) トライアドおよび他の遺伝子のホモエオログが関与する選択的スプライシングイベントの割合。

育種前として知られる、遺伝的に多様な親からの表現型の基礎となる望ましい新規対立遺伝子とハプロタイプを遺伝子移入するプロセスは、耐病性、品質、および気候回復形質を含む農業形質が改善された品種を開発するための実行可能な戦略です。しかし、多様な親間の交雑では、ドナーの親から得られる形質の浸透性や表現力が低下することがよくあります。 SHW は、Ae に存在する遺伝的多様性にアクセスするために生成されています。パン小麦のこの対立遺伝子多様性のボトルネックを克服するために、tauschii 遺伝子プール (D ゲノムドナー) が使用されました。このボトルネックでは、ゲノム背景が 2 倍体 (DD) から 6 倍体 (AABBDD) に変化すると、親形質の回復が不十分になることが報告されています 19。したがって、事前育種の可能性を高める戦略を設計するには、作物種の倍数化がゲノム全体に及ぼす影響を批判的に理解する必要がある。この研究では、SHW 系統とその対応する 4 倍体および 2 倍体前駆細胞における全体的な発現レベルの変化を調査および解明し、初期倍数化イベント中に発生するトランスクリプトームのダイナミクスを描写しました。研究に使用された 4 人の親は地理的出身が多様でした。具体的には、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍｃｖ．ラングドンは北米（ラングドン）出身で、PI377655は旧ユーゴスラビア出身で、Aeは旧ユーゴスラビア出身です。 tauschii AS2386 および AS2399 はイラン産です37,38。実験で使用された初代 SHW 植物は、少なくとも 4 世代にわたって自家受粉されていました。これらの自家受粉は、発生期の倍数体と比較してゲノムの安定化を潜在的に促進し、遺伝性トランスクリプトーム変異の捕捉を可能にします。

トライアド遺伝子セット（ABD ホメオログ染色体に 1:1:1 の状態で存在する遺伝子）は、重要な機能的役割を果たす小麦ゲノムの重要な部分を形成し、他のホメオログコピー数バリエーションとして存在する遺伝子は他の機能を実行します 40。 4 つの SHW 系統の発生的に異なる 10 個の組織すべてにおいて、親の発現レベルと比較した場合、D サブゲノムの遺伝子の大部分が SHW で抑制されていました。 Li ら 41 は、再合成小麦のトランスクリプトーム分析において、親と六倍体の状態を比較しながら発現優勢の変化を示しました。全ゲノム重複時のホモエオログ間の発現バイアスの変化は、ナタネ 42 やワタ 43 など、他の異質倍数体作物でも再合成時に観察されており、これらの種におけるサブゲノムの優勢性を反映しています。しかし、パン小麦では、サブゲノムの優位性はなく、サブゲノム間でバランスがとれていると提案されています 34,40。それにもかかわらず、組織、成長段階、および環境の合図に依存する優位性が、発達プロセスと環境適応の原因として報告されています 44,45。この研究では、SHW 系統での観察に基づいて、親状態での発現レベルの優位性が倍数化によって減少し、全体的にバランスの取れた異六倍体の達成に向けて進化のプロセスをナビゲートする一方、ホモエオログ特異的な変動性は発生または環境によって利用されることがわかりました。要件。栽培小麦の遺伝子型では、D ホモエオログの発現は A および B ホモエオログよりも抑制されていないことが判明しました 36,40。したがって、D ホモエオログに対する最初の広範な抑制効果は、異なる親 (AB と D) に由来するゲノム間の発現のバランスを確立することであり、D サブゲノムの征服のためではないと考えられます。さらに、新たに合成された倍数体で確立された発現バイアスパターンは、チャイニーズスプリング（在来種）やアズルナヤ（品種）などのより安定したゲノムからのRNA-seqデータで観察されるように、家畜化と育種のプロセスを通じて複数世代にわたって維持されます。、Ramírez-Gonzalez et al.36 に対応するオープンソースデータベースをソースとしています。したがって、新たに合成された六倍体コムギで観察される初期の新規発現パターン（Dサブゲノムの抑制）は安定化され、複数の世代にわたって受け継がれます。

倍数体化イベントにはゲノムの再シャッフリングが含まれ、複製直後、または進化中の長期間（100万年規模）にわたって遺伝子量が変化する可能性があります46。今回我々は、六倍体コムギにおける倍数化の即時効果（最初の交配から自家受粉の5世代以内）を示した。高分子複合体と下流遺伝子座に影響を与える調節遺伝子の生物学的に重要な化学量論は生物の適合性にとって重要であるため、発現バランスの変化は遺伝子量（対立遺伝子コピー）に起因すると考えられます47。組織間の同じ遺伝子セットの発現偏りの違いは、特に生殖細胞において、組織特異的なパターンで異なる重複遺伝子の発現寄与に起因する可能性があります 48,49。注目すべきことに、研究で使用された10の組織のうち5つは、生殖プールと呼ばれる一倍体の配偶体細胞の割合が高かった可能性があります。さらに別の次元では、倍数化現象は、ゲノム間のトランス調節機構の導入を通じて、遺伝子調節ネットワークの複雑さを増大させます50。これにより、小麦 45 (2n = 6x = 42)、高倍数性サトウキビ 51 (2n = 8x–12x = 80–120)、ピーナッツ 52 (2n = 4x = 40) で以前の研究で観察されたように、ホモエオアレル特異的な発現が生じる可能性があります。さらに、植物の個々の発育状態と遺伝子型も対立遺伝子の特異性に影響を与える可能性があり 51,53 、これにより、我々の調査で使用した 10 の発生的に異なる組織と 4 つの遺伝的に異なる SHW 系統にわたるホモエオアレル発現の変動がさらに説明されます。

遺伝子発現ダイナミクスは、観察された表現型の変動とその基礎となる遺伝子型を結び付ける翻訳コンポーネントです。 SHW、チャイニーズ・スプリングおよびアズルナヤで同様の発現バイアス・パターンを示すいくつかのトライアドは、このサブセットが人為的選択の影響を受けていないことを示しています。再合成小麦、栽培小麦、エリート小麦のバックグラウンドで変化するHEBパターンを持つ他の三つ組は、家畜化と作物改良の際の特定の発現バイアスパターンの選択を示唆しており、これらは現代のパン小麦の特性を調節する他の遺伝子と潜在的に共役している。この比較の限界は、研究で使用された SHW 系統がチャイニーズスプリングまたはアズルナヤの直接の祖先ではなく、発現データが異なる研究からのものであることです。したがって、複数の小麦在来種とエリート小麦品種をさらに調査することで、HEB の選択にさらに光が当たるでしょう。

組織全体にわたるトライアドの偏り傾向を調査する際、すべての組織にわたって不偏の発現パターンを示すトライアドの数が最大であり、これは、トライアドの主要なサブセットが、10 組織すべての 4 つの SHW 系統すべてで有意な偏りを示さなかったという観察と一致しています。生物的 45 および非生物的 54 ストレス応答に特異的な HEB が小麦および異質倍数体のワタで報告されています。発達段階全体にわたってトライアド特有のバイアス傾向が優勢であることを示すこの研究の結果は、ストレス反応パターンに加えて、発達段階を通じて異なるバイアス傾向をもたらすHEBの空間的および時間的変動性を示唆しています。異質倍数体ワタにおいて、繊維の発達を分析した研究により、さまざまな発達段階におけるクロマチン構造の変化と、HEB55につながる遺伝子制御ネットワーク（GRN）に対するそれらの影響が明らかになりました。これは、HEB に時空間的な違いをもたらす際の 3D クロマチン構造の動的変動の潜在的な役割を強調しています。さらに、これは、異質倍数体の発現可塑性が発生全体を通じてどのように活用されるかについても伝えています。

発現バイアスに対する環境ストレス要因の影響以外にも、ナタネ 56、ワタ 57、コーヒー 58、シロツメクサ 59 など、いくつかの異倍体種では、組織ごとの発現バイアスの変動も報告されています。六倍体コムギに関するこれまでの研究では、組織全体で多様な発現バイアスパターンを持つ三つ組がより組織特異的であることも示されている 36。 SHW トランスクリプトームを使用したこの研究では、トライアドにおけるホモオログ発現バイアスとホモオログの組織特異性の間に適度な関連性が見られ、発現バイアスの方向性の推進におけるホモオログの発現特異性の潜在的な役割が解明されました。したがって、組織、発育段階、環境の手がかり、および親の遺伝子型はすべて、四倍体および二倍体の祖先と比較した場合の六倍体小麦ゲノムの追加の可塑性を利用することにより、三徴の偏りパターンを決定します。

ホモエオ対立遺伝子間の発現パターンの比較に加えて、異なるゲノム背景間の遺伝子の発現変化を特徴付けるために行われた親株とSHW株の間の全ゲノムレベルでの差次的発現解析により、Dサブゲノム遺伝子の大規模な抑制が明らかになった。。二次および三次遺伝子プール内の種からの染色体セグメントの遺伝子移入により、小麦 60,61,62,63 と他の倍数体種 64,65 の両方でトランスクリプトーム変化が生じています。具体的には、コムギ × Ambylopyrum muticum の遺伝子移入系統のトランスクリプトーム解析により、遺伝子移入されたセグメントにおける遺伝子の発現が抑制されていることが示されました 60。同様に、小麦-大麦追加系統の発現研究では、遺伝子移入領域のより高い割合の遺伝子が下方制御されていました61。外来種のクロマチンセグメントが種に移入すると、宿主ゲノムによる外来転写物の抑制が引き起こされます。ただし、宿主のゲノムが外来のゲノムをどのように区別するかは依然として不明である。 Ae の D ゲノムを結合します。 T. turgidum の AB ゲノムを持つ tauschii は類似の応答をもたらし、SHW では AB ゲノムが天然ゲノムとして機能し、D ゲノムが導入された外来クロマチンとして機能することを示唆しています。

ゲノムレベル、したがって表現型レベルでの倍数化イベントの結果は、ハイブリダイゼーションイベントに関与する系統の遺伝的背景に依存します66,67。多様な四倍体および二倍体アクセッションに由来する複数の SHW 系統の評価では、FHB 感染に対する応答の変動が示されましたが、これは親の FHB 応答に基づいて予測できませんでした 68。遺伝子型の背景効果に基づく同様の変動が、ライ麦遺伝子移入を伴う小麦系統の収量関連形質でも観察されています69。

用量バランスを達成するため、ホモオレル特異的発現を確立するため、またはゲノムバックグラウンド効果を示すための倍数化による発現レベルの違いはすべて、潜在的に倍数化の際に起こる遺伝的およびエピジェネティックな変化の現れです。分子細胞遺伝学的手法を用いた合成系統とその四倍体および二倍体の親の染色体レベルの分析では、クロマチン領域の構造の違いが明らかにされており 70、ゲノム配列レベルの分析でも同様の結果が明らかになっている 71,72。エピジェネティックな観点から見ると、転写後遺伝子制御の主要な役割を担うマイクロ RNA (miRNA) は、再合成小麦中で非相加的に発現されました 41。 miRNA の発現の変化は、mRNA データにおける発現の偏りと抑制の下流への変化の根底にある可能性があります。二本鎖 RNA 分子に由来する低分子干渉 RNA (siRNA) は、DNA 配列、特に転移因子のメチル化に関与し、また抑制的なヘテロクロマチンマークの確立にも関与していました 73。新たに合成した六倍体小麦とそのAeの比較。 tauschii の親は、T. turgidum 対 6 倍体 A サブゲノムでの観察とは対照的に、6 倍体における D ホモエオログ上での siRNA の蓄積の増加を明らかにしました 41。 siRNA の蓄積の増加は、六倍体における D ホメログの抑制の根本的な原因である可能性があります 41。 DNA メチル化は、転移因子 (TE) のサイレンシングによる遺伝子発現制御とゲノム安定性のためのエピジェネティックな特徴です。倍数性レベルの変化は、コムギの CG、CHG、CHH 配列コンテキストのメチル化パターンの修飾を促進し、TE も関与します。 TE は小麦ゲノムの大部分を占めるため、TE にはプロモーターおよびエンハンサーモチーフが含まれるため、TE 画分のこのようなエピジェネティックな再プログラミングは、その付近の遺伝子の発現を調節します 74,75。ゲノム内の複数のヒストンマークの中で、抑制的なヒストン 3 リジン 27 ジメチル化 (H3K27me2) の増加は、小麦の倍数性の増加と正の相関があることが判明しました 76。さらに、H3K27me3 マークは制御エレメントのサブゲノム特異的活性の根底にあり 77、D サブゲノムの導入は明確なヒストン修飾とその結果として生じるサブゲノム間制御相互作用を引き起こします 29。転写因子とヌクレオソームとの関連によって制御されるクロマチンへのアクセス可能性は、Ae と比較して六倍体の D サブゲノムで低いです。 tauschii バックグラウンドも遺伝子発現の大幅な減少につながります 78。これらの遺伝的およびエピジェネティックな変化に加えて、倍数化に伴うクロマチン構造の変化も、六倍体小麦での研究を正当化します。たとえば、トポロジー関連ドメイン (TAD) と A/B 区画化の変化は、スイカ 79 やワタ 80 などの他の倍数体作物種で報告されています。

遺伝子転写後、スプライシング機構を使用して前駆体 mRNA が修飾され、成熟 RNA が生成されます。このプロセス中、スプライシング機構は選択的スプライシング (AS) によってイントロンとエクソンのさまざまな組み合わせを保持できます。この AS メカニズムは、遺伝子の転写産物と翻訳産物を多様化し、それによって空間（異なる組織）と時間（栄養段階と生殖段階）の発生枠組みにおけるその機能を変化させることができます81。組織特異的なアイソフォーム、および非生物的 82 および生物的 83 ストレス誘発性 AS イベントがあります。しかし、倍数化とその結果として生じる AS に対するゲノムショックの影響は、最近になって研究されたばかりです。 Yu らは、六倍体小麦とその四倍体および二倍体の親および親戚の研究で、保持されたイントロンが観察された最も一般的な AS メカニズムであることも発見しました 84。イントロン保持の優位性は、シロイヌナズナ 85、イネ、ソルガム、トウモロコシ 86、ワタ 87 を含む植物種全体で観察されています。差次的スプライシング事象に対する倍数化の影響は、AS88 におけるホモエオログ特異的な差異とともに、異質倍数体のナタネで観察されています。コムギおよびその前駆体の胚形成組織に由来するトランスクリプトームにおける AS の特徴付けでは、選択的 3' スプライシングイベントが圧倒的に多かったものの、その違いは分析ツールの AS イベント特異性と利用した閾値でのスプライシングパーセントに起因すると考えられています 89。

結論として、四倍体および二倍体の親と比較したSHWにおける全体的なトランスクリプトームダイナミクス解析により、18,000以上の三つ組と10の組織からの発現から推測されるように、SHWにおけるDサブゲノムの大規模な抑制をもたらすホモエオログ間の発現偏りが明らかになった。倍数化に伴う新規スプライス変異体の形で転写物間で観察される質的変化も、D ゲノムホモエオログに大きな影響を与えました。これらの量的（転写物の存在量）および質的（スプライスバリアント）の発現変化は、親のゲノム組成と小麦系統の発育段階（組織）に依存すると思われます。 D ゲノム前駆体 (Ae. tauschii) および他の野生近縁種で利用可能な遺伝的多様性を種間交雑によるコムギ改良に利用するには、倍数体バックグラウンドで望ましい表現型を回復するために、子孫における発現修飾の可能性を考慮する必要があります。

4 つの SHW 系統 (C44、C45、C65、および C66) とその 2 つの四倍体 (PI377655 ～ C16、ラングドン～ C19) および 2 つの二倍体 (AS2386 ～ C26、AS2399 ～ C30) の親、合計 8 つの遺伝子型が、研究（補足表1）。以下の 10 個の組織サンプル (補足図 1) は、上記の 8 系統から収集されました: (1) ブーツ段階の頭部、(2) 出穂時に収集されたシュート、(3) 出穂時の外皮およびパレア、(4) からの粃花穂の第一小花と第二小花、(5) 雌しべ - 葯が緑色で未熟なとき、(6) 雌しべ - 葯が黄色で裂開直前のとき、(7) 雌しべ - 開花後 1 日、(8) 黄色の葯裂開の直前、(9) 胚軸および(10) 根。後者の 2 つの組織はワットマン濾紙上で生育した若い実生から収集されました。研究では、8 つの遺伝子型すべてから組織ごとに 3 つの生物学的複製を使用しました (10 組織 × 8 遺伝子型 × 3 つの複製 = 240 サンプル)。

RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Inc.、米国メリーランド州ジャーマンタウン) を、miRNeasy mini kit (Qiagen Inc) を使用して分離された、葯が緑色で未熟な場合の成熟葯と雌しべを除くすべての組織に使用しました。抽出された RNA は、最初に Implen ナノフォトメーター (Implen Inc、米国カリフォルニア州ウェストレイクビレッジ) で定量され、品質と濃度は Agilent RNA 6000 Nano アッセイ (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) で評価されました。 cDNA ライブラリーの構築と配列決定は、Centre d'expertise et de services Génome Québec (モントリオール、ケベック州、カナダ) で実施されました。簡単に説明すると、NEBNext Poly(A) Magnetic Isolation Module (New England BioLabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国) を使用して mRNA 濃縮を実行し、続いて NEBNext RNA First Strand Synthesis、NEBNext Ultra Directional RNA Second Strand Synthesis モジュールを使用して cDNA 合成とライブラリーを調製しました。およびNEBNext Ultra II DNAライブラリー調製キット(New England BioLabs)。 PicoGreen dsDNA アッセイキットを使用してライブラリーを定量し、LabChip GX (PerkinElmer、MA、USA) を使用して品質を分析しました。正規化されたライブラリーは Illumina cBot 上でクラスター化され、成熟した葯と雌しべについて、葯がまだ未熟なときに収集された 100 bp のペアエンドリードが HiSeq 4000 プラットフォーム (Illumina Inc.、カリフォルニア州、米国) 上で生成されました。、受粉前。他の 8 つの組織は、NovaSeq 6000 プラットフォーム (Illumina Inc.) で 150 bp ペアエンドリードとして配列決定されました。

シーケンスリードは Trimmomatic90 を使用して前処理され、ゲノムインデックス作成後、Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR)91 を使用して、最近更新されたバージョンのパン小麦ゲノム擬似分子 (RefSeq v2.1; Annotation v2.1)33 にアラインメントされました。最大イントロン長は 10,000 bp、許容される不一致の最大数は 6、その他のパラメータはデフォルト設定のままです。

パン小麦のゲノムでは、遺伝子のほぼ 35% がトライアドとして存在し、各サブゲノムに 1 つの同祖コピーが含まれています (A:B:D で 1:1:1)。 Refseq v1.0 アノテーションを使用して、合計 18,474 個のトライアドが特定されました。ただし、Refseq v2.1 アノテーションで行われた改訂を考慮した後、高い信頼性でアノテーションが付けられた遺伝子モデルで構成される 18,357 個のトライアドのセット 33,34 が、この比較トランスクリプトームの研究に使用されました。遺伝子数データから発現行列が生成され、edgeR92 の rpkm 関数を使用して生カウントデータから 100 万マップ化リードあたりのキロベースあたりのリード数 (RPKM) 値が推定されました。倍率バイアスの数とその方向を表すホモエオログ発現バイアス（HEB）は、次の式を使用して推定されました35。

ここで、RPKMAB および RPKMD は、それぞれ AB および D サブゲノムからの発現値を表します。 AB サブゲノムからの RPKM 発現値については、A、B、および D ホモエオログのバランスのとれた発現レベル、および遺伝子長の違いを考慮して、トライアド遺伝子セットの A および B ホモエオログの発現レベル間の平均を利用しました。は正規化によって説明されます。

さらに、Smith et al.35 によって MATLAB 上で開発され、Edger et al.93 で最初に使用された尤度比検定を適用して、4 倍体 (AABB) または 2 倍体 (DD) ゲノムに対する有意な偏りを示す三徴を特定しました。倍数化による発現偏りのシフトを決定するために、SHW 系統からの発現データと、対応する 4 倍体および 2 倍体の親からのデータを使用して尤度比検定を実行し、サブゲノム間相互作用のないインシリコ SHW を作成しました。上流の入力準備と下流の要約ステップは、bash および R のカスタムスクリプトを使用して実行されました。組織特異的および広範に発現する遺伝子のバイアスパターンを調査するために、カットオフ 0.8 ですべての遺伝子型に対して Tau 法 94 が使用されました。。ホモエオログの組織特異性とトライアドの発現バイアスとの間の関連の強さは、Cramer's-V 統計を使用して推定され、関連の有意性は独立性のカイ二乗検定を使用して決定されました。 4 つの SHW 系統すべてにわたって同じ組織特異性を示す A、B、および D ホモエオログを含む根および成熟葯組織の 3 つ組におけるホモエオログの遺伝子オントロジー分析は、Triticeae-Gene Tribe ツールキット 95 を使用して実行されました。 LRT および組織特異性分析の入力ファイルの準備に使用される R スクリプトは、https://github.com/akshaya-v/SHW-Expression-bias で入手できます。

栽培小麦系統における HEB を解明するために、Ramírez-Gonzalez et al.36 から在来種チャイニーズスプリングと品種アズフルナヤに関する RNA 配列データが以下の組織に対してダウンロードされました: チャイニーズスプリング: 葉 (14 日目)、根 ( 14日目）、卵巣（開花初期）、卵巣（開花後期）、スパイク（起動時）。アズルナヤ：柱頭と子房（花序）、花穂（乳粒段階）、葯（花序）、根（苗木）、穂（30％穂出し）。下流の読み取り処理、アライメント、および HEB 分析は、SHW について上で説明したように実行されました。

10 個の組織からの読み取りカウントデータは 2 つのプールにグループ化されました: 栄養組織 (シュート、根、胚軸、粳、古葉 + 補題) と生殖組織 (頭部、雌しべ - 葯が緑色の場合、雌しべ - 葯が黄色の場合、雌しべ - 1 つ)開花翌日、裂開直前の黄色の葯）。そのロジックは、栄養細胞のみで構成される組織を 1 つのプールにグループ化し、栄養細胞と生殖細胞の両方で構成される組織を別のプールにグループ化することでした。 2 つのプールにおける差次的発現解析は、edgeR 統計パッケージ 92 を使用して実行され、0.05 未満の誤発見率 (FDR) および±2.00 の対数倍率変化 (LogFC) カットオフが、差次的に発現された遺伝子を推測するための閾値として適用されました。

選択的スプライシング解析は、rMATS96 を使用して実行されました。 STAR を使用して生成された BAM ファイルが利用されました。ソフトクリッピングによる位置合わせを受け入れるために、allow-clipping オプションが有効になりました。注釈ファイルに存在しない新規スプライスサイトの検出は、novelSS オプションを使用して許可されました。選択的スプライシング分析は、10 個の組織における SHW と二倍体/四倍体親の比較の可能性のある 8 つすべてに対して実行されました。サシミプロットは、rmats2sashimiplot97 を使用して作成されました。親株または SHW 株で検出された示差的にスプライシングされたアイソフォームの数と種類を比較のためにまとめました。選択的スプライスのタイプは、選択的 3' スプライスサイト、選択的 5' スプライスサイト、相互に排他的なエクソン、保持されたイントロン、およびスキップされたエクソンでした。

遺伝子型ごとに組織ごとに 3 つの生物学的複製を利用しました。 10 の組織と 8 つの遺伝子型があったため、合計 240 の組織サンプルがありました。 Smith et al.35 に記載されているように、有意な HEB を検出するための尤度比検定は、ホモエオログが AB および D サブゲノムで等しいレベルの発現を示すという帰無仮説と、ホモエオログがサブゲノム間で不等な発現レベルを示すという対立仮説を使用して実行されました。。差次的発現解析は、edgeR92 v3.38.4 を使用して、FDR < 0.05 および logFC カットオフ ±2.00 で実行されました。選択的スプライシング解析は、デフォルトのスプライシング差のカットオフ 0.01% を使用して rMATS96 で実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

生の RNA-seq データは、Bioproject PRJNA905376 の下で NCBI の Short Read Archive (SRA) に保管されています。 HEB 図、選択的スプライシング図、および組織特異性解析結果の基礎データは、Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.6443621) (ref. 98) で入手できます。

入力ファイルとその他すべての分析の準備に使用される R スクリプトのソースコードは、「メソッド」セクション内に提供されます。

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この研究は、ゲノムプレーリー (プロジェクト J-002319) からの管理支援を受けて、ゲノムカナダ、カナダ農業および農産食品、および小麦産業の関係者がパートナーシップを組む「4D 小麦: 多様性、発見、設計および提供」プロジェクトの下で支援されました。この研究はカナダ農業パートナーシップ (プロジェクト J-001961) によっても支援されました。著者らはまた、LRT MATLAB コードの説明を提供してくださった米国ウィリアム & メアリー大学の Ronald D. Smith 博士と、RNA 抽出と初期データ転送のサポートをしていただいた Sridhar Ravichandran 博士に感謝したいと思います。

カナダ農業および農業食品、オタワ研究開発センター、オタワ、オンタリオ州、カナダ

アクシャヤ・ヴァスデヴァン、マドレーヌ・レヴェスク＝ルメイ、タラ・エドワーズ、シルヴィー・クルーティエ

オタワ大学生物学部、オタワ、オンタリオ州、カナダ

アクシャヤ・ヴァスデヴァン & シルヴィー・クルーティエ

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SC が研究を設計しました。 SC、ML-L。 TE は実験を実行してデータを収集しました。 AV と SC はデータ分析方法を最終決定し、データ分析を実行し、結果を解釈して視覚化しました。 AVとSCが論文を執筆した。著者全員がその論文を読んで承認しました。

シルヴィ・クルーティエへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Arunkumar Ramesh 氏、Ahmad Alqudah 氏、およびもう 1 人の匿名の査読者に感謝します。主な担当編集者: Joao Valente。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Vasudevan, A.、Lévesque-Lemay, M.、Edwards, T. 他アロ倍数化の包括的なトランスクリプトーム解析により、合成六倍体小麦における D サブゲノムの大規模な抑制が明らかになりました。 Commun Biol 6、426 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04781-7

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受信日: 2022 年 6 月 17 日

受理日: 2023 年 3 月 30 日

公開日: 2023 年 4 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04781-7

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アロ倍数化の包括的なトランスクリプトーム解析により、