神経新生を介した可塑性は、文脈恐怖記憶想起中のCA1のニューロン活動の低下と関連している

Scientific Reports volume 12、記事番号: 7016 (2022) この記事を引用

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3 引用

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

出生後の海馬の神経新生は、さまざまな方法で学習と記憶に影響を与えることが実証されています。 いくつかの研究では、神経新生の増加により、神経新生の操作前に獲得された記憶の忘却が誘発され、この忘却の結果として新たな学習も促進される可能性があることが実証されています。 しかし、神経新生によって誘発される忘却を媒介するメカニズムはよく理解されていません。 今回我々は、前初期遺伝子c-Fosのサブ領域ベースの解析と生体内ファイバー測光法を用いて、神経新生によって誘発される忘却に対応する活動の変化を判定した。 私たちは、神経新生の増加により、文脈記憶想起中の CA1 活性が低下することを発見しました。 我々はここで、CA1領域におけるニューロン周囲のネット発現が、歯状回において出生後に生成されたニューロンのレベルまたは活性によって双方向に変化することも実証する。 これらの結果は、神経新生が、記憶を劣化から保護する可能性があるCA1の神経周囲ネットを破壊することによって忘却を誘発する可能性があることを示唆しています。

哺乳類の脳における出生後の新しいニューロンの増殖と統合は、新しい接続を生み出すと同時に既存の回路を破壊する可能性を秘めた可塑性の独特な形です。 結果として、海馬の構造と機能の調節因子として、出生後の神経新生には多くの意味があります。 最近の理論の中には、出生後の神経新生が海馬回路を形成して将来の学習を最適化するのに重要であることを示唆するものもあります1。 これまでの他の研究では、多くの場合、神経新生レベルの上昇が学習 2、3、4、記憶 5、6、認知の柔軟性 4、7 などのプロセスにプラスの影響を与えることが実証されています。 最近の研究では、神経新生が学習と記憶にプラスの影響を与える可能性があることに加えて、神経新生の上昇前に形成された記憶の弱体化もあることが示されています8,9,10,11,12,13,14。 15. 結局のところ、出生後の神経新生のこの役割は、古い記憶と新しい記憶の間の積極的な干渉を軽減するため、有益でもあります。 これは、逆転学習の場合など、2 つの記憶の間に矛盾がある状況で特に発生します。 結果として、神経新生によって誘発される忘却は、新しい記憶をより速く獲得できるため、学習に有益です10。 神経新生のこの「逆行性」効果は、さまざまな種類の記憶に影響を及ぼし、女性と男性の両方で発生し、神経新生レベルがどのように増加するか（つまり、遺伝的、化学的、物理的方法）に関係なく発生します。 逆に、神経発生が減少すると、以前に獲得した記憶の忘却が減少し、新しい矛盾する記憶の獲得が遅くなります10。 まとめると、これらの結果は、安定性と可塑性のバランスを維持するための出生後の神経新生の重要性と、これが学習と記憶をどのように優先的に調節するかを示しています。

神経新生によって引き起こされる忘却は、強力で信頼できる現象です8、9、10、11、12、13、14、15。 しかし、記憶力の低下を媒介するメカニズムは明確には特定されていません。 新しいニューロンは既存の海馬回路に統合され、その結果、既存の成熟したシナプスを上書きする可能性があります16、17。 そのため、新しく生まれたDG細胞が接続を形成し、元の記憶痕跡の再活性化の失敗につながるため、神経新生がCA3回路への苔状線維の再構成を介して忘却を引き起こすと提案されています8。 海馬回路に対する神経新生の影響の計算モデリングにより、ネットワークが所定のパターンで訓練された後に、より興奮しやすい新しいユニットを DG に追加すると、以前に活性化された CA3 ユニットの再活性化率が低下することが判明しました。そのパターン18． 実際、神経新生の除去は、恐怖想起中の CA3 のエングラム細胞の再活性化を阻害し 19 、新しく生まれた DG 細胞が記憶想起中の CA3 の活性に重大な影響を与えることを示しています。

潜在的なメカニズムに関する計算モデルと予測は、これまで、DG とその直接の入出力構造 (嗅内皮質や CA320、21、22) との重要な相互作用に重点を置いていました。 出生後に生まれた顆粒細胞は、成熟の初期段階で興奮性ニューロンよりも CA3 介在ニューロンに優先的にシナプスを形成します 23。これは、新しいニューロンの追加が古い苔状線維接続を「上書き」する効果があるだけでなく、抑制性ニューロンの広範な増加を引き起こす可能性があることを意味します。 CA3内のドライブ。 CA3 の効果が役割を果たしているのはほぼ間違いありませんが、神経新生は苔状線維経路を超えて下流に影響を与えることが示されています。 例えば、神経新生の増加は、CA3 および CA116,21 における阻害の増加を引き起こします。 シェーファー側副経路が苔状線維経路よりも密な接続性を持っていることを考えると、神経新生によって誘発される CA3 活性の変化は CA1 活性のさらに大きな変化を引き起こす可能性があります。 したがって、我々はここで、DG、CA3、およびCA1の活性に対する出生後の神経新生の影響を調べることを目的としました。

私たちは、出生後の神経新生が下流の海馬小領域の活動や興奮性を変化させることによって、以前に獲得した記憶の想起を妨げるのではないかと仮説を立てました。 私たちは、記憶想起中の海馬小領域の活動における神経新生依存性の変化を調べることにより、この仮説を検証しました。 我々の結果は、神経新生誘発性忘却の根底にあるメカニズムとして、神経周囲網の劣化によって媒介される可能性のあるCA1活性の変化を示している。 これらの発見は、出生後の神経新生の逆行性効果の機構的な説明を提供するものであり、出生後神経新生の記憶促進性の順行性効果と、逆行性方向で観察される忘却促進性の効果とを調和させるのにも役立つ。

私たちの最初の目標は、自発的な運動が逆行方向の記憶保持に及ぼす影響を確認することでした（図1a）。 そのために、まずマウスを訓練して文脈上の恐怖記憶を確立させました（図1b）。 神経新生を促進するために、マウスの半数には4週間回し車を与え、残りの半数は標準的な飼育環境で座り続けた。 この操作の後、ランニンググループにおける記憶想起の大幅な減少が観察されました（図1c）。これは、神経新生の亢進が物忘れを誘発するという以前の報告と一致しています。 ランニングにより神経新生が増加したことを確認するために、未熟ニューロンマーカーDCXを調べ、ランナーの歯状回における標識細胞数の大幅な増加を観察しました（図1d、e）。 自発的な運動後の文脈的記憶の破壊が操作前に取得された記憶に特有であるかどうかを判断するために、文脈的恐怖条件付けの前にマウスに回し車へのアクセスを与える前向性スタイルの実験を実行しました（補足図S2a）。 次に、30日後にマウスをテストしました。 以前の自発的運動にもかかわらず、文脈的恐怖記憶の獲得（補足図S2b）またはその後の想起（補足図S2c）において、対照グループとランニンググループの間に有意差は観察されませんでした。 これらの結果を総合すると、自発的な運動が神経新生の大幅な増加を誘導し、既存の海馬依存性の記憶の強度を強力に調節することが実証されています。

ランニングは神経新生を誘発し、以前に取得した情報の忘却を促進し、CA1 活性を変化させます。 （ a ）状況条件付けパラダイムで訓練した後、記憶保持をテストする前に、マウスを30日間従来どおりに飼育するか（n = 14）、または回し車へのアクセスを与えます（n = 14）。 (b) 文脈上の恐怖条件付け中に、グループ間でフリーズに費やされる時間の割合に差はありませんでした。 (c) ランニングは、座りっぱなしの対照マウスと比較してすくみの減少によって測定されるように、条件付けされた状況の忘却を促進しました。 （ d ）対照群および走行群のマウスの歯状回におけるダブルコルチン標識（シアン）の例。 スケールバー、50μm。 (e) ランニングホイールへのアクセスを与えられたマウスは、神経新生の増加を示しました。 (f) 文脈的恐怖条件付け記憶想起中の海馬サブ領域の c-fos + ニューロン (シアン) の例。 海馬の概要スケール バー、500 μm。 高倍率スケールバー、50μm。 (g) ランニングにより、DG または CA3 の c-fos + ニューロンの密度は変化しませんでしたが、CA1 領域での c-fos 発現が増加しました。 (h) この変化は効果サイズ (コーエンの d) のプロットでさらに示されており、CA1 ではブートストラップされた 95% CI を超える条件依存の減少のみが存在することが示されています。 データ分析には、2 サンプル T 検定 (b、c、e)、Tukey の事後検定を使用した ANOVA (e)、および効果量 (h) の尺度として Cohen の d を使用した複数 2 グループ推定統計を使用しました。 *P < 0.05。 示されているデータは平均値 ± 標準誤差です。完全な統計分析については補足表 S1 を参照してください。

いくつかの以前の研究8、9、10、11、12、13、14、15は、以前に獲得した記憶の忘却が出生後の神経新生速度の上昇によって誘発されることを実証しており、今回の結果はこれらの以前の発見を裏付けています。 私たちの次の目標は、記憶が弱まるメカニズムを解明するための第一歩として、神経新生による忘却の根底にある海馬活動の破壊されたパターンを観察できるかどうかを判断することでした。 そうするために、我々は、さまざまな海馬​​小領域における活性化ニューロンの代理として c-fos 発現を調べました 28、29、30、31、32。 c-fos発現における領域ごとの重要なグループ相互作用を観察しました（図1f-g）。 歯状回または領域 CA3 における c-fos 発現密度に有意差はありませんでした。 しかし、ランニンググループでは、コントロールグループと比較して、CA1領域のc-Fosが大幅に減少しました。

この差は CA1 のみで有意でしたが、CA3 でも同様に c-fos 発現の減少傾向が観察されました。 これらの変化をさらに分析するために、推定統計を実行して各サブ領域の効果の大きさを調べました。 興味深いことに、DGからCA3およびCA1まで増加する効果の勾配があるようです（図1f-g）。これは、出生後の神経新生の影響が、海馬の下流よりもその物理的統合部位で小さいことを示唆しています回路。

また、記憶獲得前の自発的運動によって神経新生が調節される順行性状態のマウスからのc-Fos発現も調べた。 上で議論したように、前行性状態ではランニングの結果として記憶障害はありませんでした。 さらに、この条件では、その後の記憶想起中に海馬の小領域のいずれでもc-Fos発現にランニングの影響はありませんでした（補足図S2d、e）。 これは、逆行性状態における CA1 c-Fos の減少は記憶保持力の低下の結果であるという考えを強く裏付けています。

CA1領域における記憶想起障害の活動依存性の兆候を特定したので、次にこの領域でファイバー測光を実行し、神経新生によって誘発される忘却に関連する活動の変化をより微妙に理解しました。 文脈的恐怖学習中およびランニング後の記憶想起中にCA1領域の集団活動を監視するためにGCaMP7f33をウイルス発現させた点を除いて、上記と同じ行動パラダイムとタイムラインを使用しました（図2a、b）。 私たちのc-Fos実験（図1）に示されているように、私たちはまず自発的なランニングが神経新生を増加させることを実証し（図2c、d）、自発的なランニングによって神経新生が増加する程度に応じて、すくみの大幅な減少が観察されました（図2e)。 また、ランナーの神経新生と記憶保持の間に有意な相関関係があることも発見しました（図2f）。 自発的な運動操作の前に、トレーニング中の文脈上の恐怖の獲得やファイバー測光関連の指標においてグループの違いは観察されませんでした（補足図S3）。 1か月のランニング後、清潔なマウスケージで測光記録を実行し、ランニングがCA1集団の活動に非特異的（つまり、非記憶的）影響を与えたかどうかを判断しました（補足図S4に示されている代表的な記録）。 ベースラインのカルシウム活性に関して、ランナーグループと座りがちなグループの間に有意差はなく（図2g）、自発的な運動はCA1活性の全体的な変化を引き起こさないことを示しています。 その後、すぐにマウスを状況的恐怖室に移しました。 そうすることで、GCaMP7f の増加が観察されました。 対照グループの活動は、ランナーでは大幅に減少しました（図2h）。 各測光トレースの曲線の下の面積を計算し、この測定基準が、コントロールグループとランニンググループの両方でフリーズに費やされた時間によって測定される記憶力と有意に相関していることを観察しました（図2i、j）。 これらの最初の測光結果は、記憶想起に特有の自発的な運動後の CA1 における集団活動の低下を示しています。 これは、図 1 に示す c-Fos 発現の変化と一致しています。

ランニング誘発性の神経新生は、CA1 の行動特異的活性を増加させます。 (a) マウスを GCaMP7f に感染させた。 文脈的恐怖条件付けの前に。 次に、記憶試験の前に、マウスを従来通り (n = 14) または回し車付き (n = 10) で 30 日間飼育しました。 ファイバー測光は、トレーニングと記憶の回復中に実行されました。 (b) GCaMP7f の代表的な顕微鏡写真。 表現（シアン）。 概要スケール バー、100 μm。 CA1スケールバー、100μm。 (c) ランナーは神経新生の増加を示しました。 (d) コントロールとランナーのダブルコルチン標識 (シアン) の例。 歯状の概要スケール バー、100 μm。 高倍率スケールバー、50μm。 (e) ランニングはコンテキスト記憶の忘却を促進しました。 (f) ランナーでは、ダブルコルチン標識の増加は記憶力と相関していました。 （g）保持テスト前の清潔なホームケージでの測光記録中に、平均GCaMP7fに差はありませんでした。 ランナーとコントロール間のアクティビティ。 (h) 条件付けチャンバーに移すと、対照マウスは平均 GCaMP7f の有意に大きな増加を示しました。 ランナーと比較した、あるコンテキストから次のコンテキストへのアクティビティ。 (i) 平均 GCaMP7f。 上にプロットしたグループフリージング中央値を使用したコンテキスト記憶テスト全体にわたる蛍光。 ベースライン補正されていないグループ平均トレースと代表的な個人の記録については、図 - 補足図 1 を参照してください。 (j) 両方のグループの GCaMP7f の下の領域。 試験全体にわたる蛍光曲線は、凍結率と有意に相関していた。 次に、測光記録を行動表現によって分離しました。 (k) 行動表現に関係なく、ランナーでは曲線下の面積が抑制されました。 (l) 測光信号の平均ピーク高さは、条件間または行動表現によって異なりませんでした。 (m) 対照マウスは GCaMP7f の増加を示しました。 凍結に対する移動中のピーク周波数 (ピーク/秒)。 ランナーは、運動中にこの行動特有の頻度の増加を示せませんでした。 データ分析には、2 サンプル T 検定 (c、e、g、h) および Tukey の事後検定を使用した二元配置分散分析 (k、l、m) を使用しました。 *P < 0.05。 示されているデータは平均値 ± 標準誤差です。完全な統計分析については補足表 S2 を参照してください。

次に我々は、すくみ行動と非すくみ行動の間のCA1活性の差に基づいて、対照群とランニング群を区別できるかどうかを判断することに興味を持ちました。 AUCを調べたところ、ランナーの大幅な減少が観察されました（図2k）。 ただし、これは移動中と凍結中の両方で一貫して減少しました。 また、ピーク頻度も分析したところ、グループの有意な主効果はありませんでしたが、行動による有意なグループの相互作用が存在しました。 平均ピーク高さを調べたところ、この指標はグループ間で有意な差がなく、また、凍結行動と非凍結行動の関数としても変化しないことがわかりました（図2l）。 凍結の発作中、コントロールとランナーの両方が低いピーク頻度を示しました。 運動の発作中、対照マウスは、ランニンググループでは観察されなかったCA1ピーク周波数の有意な増加を示しました（図2m）。 これは、ピーク周波数における行動依存の違いは、追加のニューロンの補充によるものではなく（この場合、ピークの高さの増加が予想される）、代わりに同じニューロン集団の周波数の変化によるものである可能性が高いことを示唆しています 34。

ニューロン周囲ネット (PNN) は、可塑性、興奮性、記憶力の調節における役割を提案しています 35,36,37。 これまでに、車輪へのアクセスや年齢などの要因が海馬における PNN の発現密度を変化させることが実証されています 38,39。 どちらの要因も神経新生に影響を与えますが、この 2 つの間の関連性は仮説が立てられているだけです 40。 我々は、出生後の神経新生とPNNの発現パターンとの関係が、関連する記憶発現の低下を説明できる可能性があると推測した。 したがって、我々は、自発的な運動による神経新生の学習後の操作を受けたマウスのDG、CA3、およびCA1におけるPNNの密度を定量化しました（図3a）。 興味深いことに、c-Fos発現で観察されたのと同じ変化パターン、つまりランニンググループのCA1におけるPNN密度の減少と領域ごとのランニング相互作用が観察されました（図3b、c）。 高倍率共焦点顕微鏡を使用して、CA1 に残っている PNN の表面積を調べたところ、全体の数の減少に加えて、ランニング グループの表面構造の連続性も減少していることがわかりました。 PNN の劣化の様子（図 3d–f）。 興味深いことに、ニューロン周囲のネット発現が神経新生自体によって破壊される程度を調べるために、PNNの隣接性と密度の両方をDCX標識された未熟ニューロンの数と相関させました。 どちらの場合も、対照グループでは強い逆相関（連続性の場合に有意であり、PNN密度とほぼ有意な傾向）があったのに対し、ランニンググループではこれらの相関は弱く、有意ではありませんでした（図3g、h）。

ランニング誘発性の神経新生は、CA1 のニューロン周囲ネットの密度と隣接性を減少させます。 (a) CA1、CA3、および歯状回の高倍率画像を含む、海馬全体の PNN 発現 (シアン) の代表的な顕微鏡写真。 海馬の概要スケール バー、500 μm。 高倍率スケールバー、50μm。 (b) コントロール (n = 8) およびランナー (n = 7) における PNN 発現密度。 スケールバー、250 μm。 (c) ランニング誘発性の神経新生は、CA1 における PNN の発現密度を減少させました。 (d) PNN の高解像度画像が CA1 から収集され、(e) 連続性を評価するためにしきい値処理を使用して二値化されました。 スケールバー、25 μm。 （ f ）ランニング誘発性の神経新生は、CA1のPNNの隣接性を減少させました。 対照条件では、ダブルコルチン + 細胞の密度は、(g) CA1 PNN 発現密度および(h) CA1 PNN 隣接性と逆相関する方向に高度に傾向がありましたが、これらの相関はどちらもランニング条件では有意ではありませんでした。 データ分析には、ポストホック多重比較中のテューキー検定による ANOVA (c) および 2 サンプル T 検定 (f) を使用しました。 *P < 0.05。 示されているデータは平均値 ± 標準誤差です。完全な統計分析については補足表 S3 を参照してください。

神経新生が確かにCA1におけるニューロン周囲ネットの発現を調節している因子であるかどうかをさらに決定するために、我々は出生後の神経新生の追加の調節因子を調査した。 神経新生を増加させる追加のメカニズムとして、マウスをメマンチン 11 で処理し、神経新生を減少させるためにテモゾロミド 41 (TMZ) を使用しました。 生理食塩水を注射したマウスと比較して、自発的ランニングで観察されたのと同様に、メマンチン治療により CA1 における PNN 発現が大幅に減少しました (DG や CA3 では減少しませんでした)。 一方、TMZは神経新生を減少させ、その後CA1におけるPNNの発現を増加させました（図4a、b）。

歯状回の未熟顆粒細胞の活性は、CA1 のニューロン周囲ネットの密度に反比例します。 （ a ）4週間のTMZ処理（n = 5）は、生理食塩水処理対照（n = 5）と比較して、CA1におけるPNNの発現密度を増加させ、メマンチン処理（n = 5）は発現密度を減少させた。 この治療効果は歯状回やCA3には存在しませんでした。 (b) メマンチン処理は神経新生の増加を誘導しましたが、TMZ 処理は生理食塩水処理対照と比較して神経新生を減少させました。 (c) CA1 における PNN の発現密度は、思春期を通じて年齢とともに増加しましたが、その間 (d) 神経新生は減少しました。 （ e ）文脈条件付けの14日前に、tg + （n = 4）およびtg-（n = 4）Nestin-ChR2マウスの歯状回に光ファイバーを移植しました。 次に、歯状回のネスチンを発現する未熟ニューロンを、10 Hz で毎日 5 分間、14 日間刺激しました。 条件付けから 28 日後に、マウスを条件付けされた環境に再導入しました。 (f)条件付けされた状況への再導入中に、ChR2 tg + マウスは、ChR2 tg- コントロールと比較して記憶障害を示しました。 (g) ChR2 tg + マウスも CA1 PNN 発現密度の有意な減少を示しました。 (h) 記憶想起と CA1 PNN 発現密度のこれらの変化は、ダブルコルチン + 未熟ニューロンの発現密度に差がない場合に発生しました。 データ分析には、ポストホック多重比較中のテューキー検定による ANOVA (a ～ d) と 2 サンプル T 検定 (f ～ h) を使用しました。 *P < 0.05。 示されているデータは平均値 ± 標準誤差です。完全な統計分析については補足表 S4 を参照してください。

海馬における出生後の神経新生は、動物の年齢に大きく依存します。 若齢マウスは老齢マウスよりも神経新生のレベルが著しく高く、神経新生の減少は人生の早い段階で始まります 14,42。 したがって、我々は、PNN発現の違いを調べるために、出生後の神経新生の追加の天然調節因子として年齢を使用することを試みました。 出生後に生成されたニューロンの統合が実際に CA1 PNN 発現を負に制御する場合、年齢の増加に伴う PNN 発現の増加が予想されます。 これをテストするために、生後 1、2、または 4 か月のマウスの CA1 における PNN 発現を定量しました。 予想通り、CA1では神経新生の有意な年齢依存的な減少と、それに対応するPNNの年齢依存的な増加が観察されました（図4c、d）43。 これらの結果は、歯状回における出生後の神経新生のレベルが CA1 PNN 発現に影響を与えることを裏付ける証拠をさらに提供します。

総合すると、これらのさまざまな操作の結果は、出生後の神経新生が CA1 領域における PNN 発現を調節したことを強く示唆しています。 しかし、DG における出生後の神経新生は CA1 における PNN 発現にどのような影響を与えるのでしょうか? 直接的および/または局所的なニューロン活動は、以前に PNN の修飾に関連付けられていました 44、45、46。 私たちは、出生後に生成されたニューロンの活動が DG の回路活動を変化させ、その結果 CA1 の PNN 変化を引き起こす可能性があると仮説を立てました。 新しいニューロン活動の影響を調べるために、Nestin-Cre/ERT2 マウス系統を使用して未熟なニューロンで ChR2 を発現させました。 この未熟なニューロン集団の光遺伝学的刺激は、文脈的恐怖条件付けの 24 時間後から 2 週間毎日適用されました。 この光遺伝学的アプローチは、最初の学習から1か月後にテストした場合、以前に獲得した文脈的恐怖記憶の忘却を誘発するのに十分でした（図4e、f）。 光遺伝学的刺激は、非刺激対照群と比較して、CA1におけるPNN発現を有意に減少させた（図4g）。 しかし、DG内のDCX + 細胞の数は増加しませんでした（図4h）。 これらの発見を総合すると、DG の未熟なニューロンの活動が CA1 PNN 発現に直接影響を与える可能性があることが実証されています。

我々や他の研究者らは、出生後の神経新生の亢進は、神経新生が亢進する前に獲得された記憶の強さと逆相関していることを実証した8,9,10,11,12,13,14,15。 ここで我々は、この形態の神経新生誘発性忘却の根底にあるメカニズムを調べようとしました（図5）。 私たちは、忘却に関連する HPC における経験依存的な c-Fos 発現の変化を特定することから始めました。 われわれは、文脈的恐怖記憶の想起の低下が、特にCA1サブフィールド内でのc-Fos発現の低下を伴うことを発見した。 この結果は、記憶想起におけるCA1の重要性を示しており、出生後の神経新生がこの領域での記憶の保存および/または想起を混乱させることを示唆しています。 CA1 は状況恐怖記憶の想起中に活性化することが示されており 47,48、恐怖記憶想起の障害は CA149,50 の光遺伝学的破壊によって誘発される可能性があります。 CA1 は、それ自体記憶領域として機能するのではなく、CA351 に直交化された方法で記憶されたメモリのデコード回路として機能することも提案されています。 CA1 の正確な機能とは関係なく、CA1 の活動の中断は記憶の想起に重大な影響を与えることは明らかです。

調査結果の要約。 総合すると、これらの結果は、神経新生の増加が CA1 領域の活性および PNN 発現密度に大きな下流効果を引き起こすことを示しています。 興味深いことに、これらの領域は出生後に生まれた顆粒細胞により近いにもかかわらず、この効果はDGおよびCA3には存在せず、c-Fos発現密度のPNNにおける差異は報告されなかった。 これに基づいて、神経新生によって誘発される忘却の重要なメカニズムが、CA1の遠位および下流に現れる生理学的変化にあることを示唆します。

神経新生誘発性の忘却に関連するCA1の活性変化をさらに調査するために、生体内ファイバー測光を実施しました。 神経新生の増加（または自発的運動の非特異的効果）が、回復を妨げる活動の全般的な低下をもたらした場合、Ca1 のベースライン Ca2+ シグナルの減少が予測されます。 しかし、我々は活動のベースラインの差を観察しなかったが、その代わりに、物忘れがCA1集団のCA2+信号の全体的な状況特異的な減少、および運動中のピーク頻度の行動依存的な減少と関連していることを実証した。 記憶想起障害中のCA1におけるこれら2つのニューロン活動の代理の減少は、CA1が文脈記憶の保存において重要な役割を果たしており、神経新生の増加がCA1における記憶保存を調節することによって忘却を誘発することを示唆している。

信号に対するモーションアーチファクトの影響を防ぐために、ファイバー測光データを評価する際に考慮すべき重要な制御があります。 470 nm GCaMP チャネルに加えて、ファイバー測光の標準である 415 nm チャネルからの蛍光強度も記録しました 52,53,54,55,56。 415 nm チャネルは GCaMP7f33 の等吸収点と一致します。 したがって、この波長に応答して記録された蛍光強度は、カルシウム結合とは無関係であると考えられます。 等浸透圧チャネルで観察された蛍光シグナルの偏差は、動きとノイズ関連のイベントであると推定され、チャネルを考慮してシグナルを線形にスケーリングした後、ノイズ関連シグナルを減算することで、カルシウム依存性 GCaMP シグナルの事後制御が行われます。 -関連した応答振幅の違い57,58。

現在の研究では、測光信号を行動記録と同期させました。 これにより、離散的な運動の発作中と、記憶保持の代用であるマウスのすくみの間の測光信号を比較することができました。 文脈記憶の想起中、測光トレースの曲線の下の領域は動きと高度に相関していましたが（図2j）、動きのアーティファクトによるものである可能性は低いです。 この相関関係がモーション アーティファクトの結果である場合、それはコンディショニング セッション中にも予想されたはずです。 ただし、測光トレースの曲線の下の領域の大きさは、文脈記憶の取得中の動きと相関しないことがわかりました（補足図S3c）。 これは、測光信号と動きの関係が動きのアーチファクトに関係しているのではなく、文脈上の恐怖記憶の代理としての種特有のすくみ反応に関係していることを示唆しています。 現在のプロジェクトで実施されている測光分析に対する潜在的な注意点は、ベースライン記録期間中に運動追跡が欠如していることです。 ただし、コンテキスト条件付け中に観察された運動行動には違いはありませんでした（補足図S3a）。

CA1の活性に対する神経新生の影響を評価した後、次に、調節、可塑性、および興奮性におけるこれらの細胞外マトリックス成分の提案された機能に基づいて、海馬サブ領域における神経周囲ネットの神経新生によって誘発される変化を調査しました59。 我々は、海馬のCA1領域におけるPNN発現に対する、出生後の神経新生の正のモジュレーター（ランニング9、10、12、メマンチン11）と負のモジュレーター（TMZ9、老化60）の影響について一致した証拠を提供する。 神経新生の減少は領域 CA1 内の PNN 発現の増加と関連していましたが、神経新生の増加は CA1 における PNN 発現の減少と関連していました。

これまでの証拠は、CA1 領域のニューロン周囲ネットが長期記憶の安定性を保護し、その除去によりパルブアルブミン発現介在ニューロンの活性増加が関与する機構を通じて記憶記憶が減少することを示しています 35。 CA1 ニューロン周囲ネットの除去が長期うつ病 (LTD) を制限するように作用することも示唆されています 37,61。 LTD がシナプスの除去につながる可能性があることを考えると 62、これも記憶発現の低下につながる可能性があります。 これらのメカニズムのいずれか、または両方は、出生後に生成されたニューロンの数または活性の増加から特定された CA1 ニューロン周囲の正味発現の減少によって誘導される可能性があります。 これらのメカニズムは、ここで観察された CA1 活性の減少パターンとも一致しています。 以前に示されているように、ニューロン周囲の正味の減少が PV 介在ニューロンの頻度を増加させる場合、c-Fos 発現と GCAMP7 活性の点で観察されたように、結果として CA1 の興奮が減少すると予想されます。

加齢および自発的運動に伴う CA1 PNN 発現密度の変化に関する我々の発見は、以前の報告と一致しています 38,39。 しかし、これらの以前の報告では、両方の条件下で変化するプロセスである神経発生を評価していませんでした。 本研究では、出生後に生まれたニューロンが変化する 5 つの条件にわたって、CA1 における PNN 発現密度の変化を実証しました。 さらに、我々はここで、新しいニューロンの数を変えることなく、歯状回において出生後に生成された未熟なニューロンを直接光遺伝学的に刺激すると、以前に獲得した記憶の忘却を誘発し、CA1領域のニューロン周囲ネットのリモデリングを誘発することを示す。 このパターンは、出生後の神経新生の調節因子としてのランニングで観察された行動現象を再現しています。 これまでに、ランニングと出生後の神経新生のトランスジェニック阻害を組み合わせて、以前に獲得した記憶の忘却に対するランニングの効果が特に神経新生の増加に依存していることが実証されています。 新しいニューロンの直接的な光遺伝学的刺激が物忘れを誘発するという我々の観察は、この現象における神経新生に関連する出生後に生成されたニューロンの興奮性の増加の特異的効果のさらなる証拠を提供する。

最近の研究では、海馬のニューロン周囲ネットの密度が、DREADD を使用した直接人工刺激または阻害によって双方向に変更できることが実証されました 46。 しかし、我々の知る限り、我々の現在の結果は、関心領域に局在する刺激やPNN自体を標的とした刺激ではなく、多シナプス経路を介して起こるニューロン周囲ネットの活動誘発性破壊を初めて実証したものである。 これは、出生後の神経新生が歯状回およびCA3近位の局所回路の構造的接続を調節する可能性があるものの、新しいニューロン活動の機能的影響が歯状回に直接接続されていない領域で観察される可能性があることをさらに強調している。 以前の研究では、DG の新しいニューロンが肺門介在ニューロンおよび CA3 介在ニューロンと優先的に組み込まれることがわかっています 23。 したがって、神経新生の増加により、DG から CA3 へのより抑制的な駆動への移行が生じ、その結果、DG 下流の c-Fos 発現が減少した可能性があります。 さらに、神経新生の増加により、CA3 と CA1 の抑制が増加し、両方の領域でのパルブアルブミン介在ニューロンの活性が増加し、CA1 の鋭波リップルが減少することが示されています 63。

c-fos と PNN の効果が CA1 で最大であるように見える理由は、DG-CA3 の接続が CA3-CA1 の接続に比べてかなりまばらであるためである可能性があります 24,25,27。これは、理論的には、CA3 の集団活動に小さな変化があることを意味します。 CA1 における下流の影響が増幅された可能性があります。

本研究は、雌マウスにおける神経新生によって誘発される物忘れの証拠を提供し、このメカニズムが部分的には、記憶を劣化から保護する可能性があるCA1の神経周囲ネットの破壊によって媒介される可能性があることを示唆している。 神経新生によって誘発される忘却のこの行動的影響は、雌と雄の両方のげっ歯類で以前に実証されています9、10、11、13。ただし、根底にあるメカニズムは異なる可能性があります。 性差は、状況条件付け中の行動64,65,66と神経新生速度67,68,69の両方に存在するため、今後の研究ではこれらの結果を拡張し、CA1 PNN発現密度の変化が雄マウスにも存在するかどうかを評価する可能性がある。

本研究の結果は、積極的な干渉の影響を軽減する神経新生の理論と一致しています8、9、70。 若い脳では神経新生の速度がはるかに高いため、出生後の神経新生は、進行中の海馬機能の構成要素としてではなく、回路形成のメカニズムとして青少年にとって最も重要である可能性があると提案されています71,72。 しかし、出生後の神経新生は、成体および高齢の動物でも、割合は低いとはいえ継続します73、74、75、76、77、78。 計算モデリングにより、DG 顆粒細胞の総集団のわずか 0.2% しか生成しない神経新生率でも、積極的干渉の減少と一致する行動効果を誘導するには十分であることが実証されています 79。 したがって、私たちはこれら 2 つの理論が両立しない、または相互に排他的であるとは考えていません。

本研究では、マウスの脳内で観察された効果のみを報告できるため、人間の神経新生が積極的な干渉の忘却と制御において同様の役割を果たすことができるかどうかは不明のままです。 成人の脳における神経新生は、多数の研究によって記録されています78、80、81、82、83、84、85、86、87。 いくつかの最近の研究により、成人の脳における少なくとも出生後の神経新生の存在についての論争が再燃している88、89、90。 成人の脳における神経新生を観察した多くの研究では、新しいニューロンの生成率は比較的低い78。 しかし、上で議論したように、計算モデリングは、出生後の神経新生のレベルが非常に低い場合でも物忘れを誘発する可能性があることを示唆しており、そのため、成人における神経新生のレベルが低いことは、人間の脳におけるこの機能を妨げるものではありません。 既存の知識に基づいて、神経新生によって誘発される忘却の翻訳可能性を判断することはまだ不可能です。

学習と記憶の両方を最適化するには、回路の可塑性と安定性のバランスが必要です。 これまでの研究では、神経新生による忘却には新たな学習の促進が伴うことが実証されています10。 この多面的な効果は、回路のバランスを変化させて取得を促進し、検索のために回路の安定性を必要とする記憶を破壊する可塑性の増加によって単純に説明できるだろう。 機構的に、本発明者らは、出生後の神経新生が、CA1領域における神経周囲網の活動依存性調節を通じてこの回路バランスを変化させるという強力な証拠を提供する。 現在の研究では、神経新生による忘却に関連するメカニズムを調査しましたが、神経新生が関与していると考えられている機能はこれだけではありません。出生後の神経新生は、気分調節を含む多くの役割を果たすことが示されているか理論化されています91,92,93,94,95。 、認知の柔軟性96,97,98、パターン分離4,12,99,100、長期記憶101,102,103。 したがって、私たちは出生後の神経新生に単一の機能があるとは期待していません。 出生後に生成されたニューロンと既存のニューロン回路との間の相互作用は複雑であり、これらの他の要因（認知や気分など）に影響を与える別個の下流メカニズムが存在する可能性があります。 しかし、PNN の調節に関しては、生後神経新生の提案されている機能のいくつかを部分的に媒介する可能性がある共通のメカニズムも存在する可能性があります。 例えば、CA1 を含む複数の脳領域における PNN 発現は、ストレス障害や気分障害に関係しています 104、105、106。 同様に、PNN は学習61,107、記憶35,59,108、認知の柔軟性109,110、発達回路の形成111,112にとって重要です。 変化したPNN発現が出生後の神経新生の他の機能をどの程度媒介するかを決定するには、今後のさらなる研究が必要である。

2系統のマウスを使用しました。 C57Bl/6N バックグラウンド マウス (JAX) をほとんどの実験に使用しました。 ネスチンプロモーター配列 (JAX) の下で CreERT2 を発現するトランスジェニックマウス系統も、未熟ニューロンの光遺伝学的標的化に使用されました。 すべての実験にはメスのマウスが使用され、試験開始時に生後 7 週間でした。 マウスは標準的なケージに収容され、ケージあたり 3 ～ 5 匹のマウスが収容され、餌と水は自由に摂取できました。 部屋の照明は、12 時間/12 時間の明/暗サイクル (午前 8 時、照明オン) に維持されました。 すべての行動試験と測光実験は光サイクル段階で実施されました。 実験はカナダ動物管理評議会の方針とガイドラインに従って実施され、カルガリー大学動物管理委員会によって承認されました。 この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

神経新生を増加させるために、マウスにホームケージ内で 1 か月間、ランニングホイール (Fast Trac™、Med Associates Inc.、フェアファックス、バーモント州、米国、直径 16 cm) を自発的に使用させました。 自主的なランニングは再現性が高く、神経新生を促進するために広く使用されているアプローチです。 ここで選択されたのは、行動への影響が神経新生の増加に特異的に依存することが判明した、神経新生誘発性の忘却を調べる以前の実験で使用されていたためです9、10、12。 マウスを回し車の上にそっと置き、回し車から外れる経路を妨げることによって、回し車を使用するように訓練した。 マウスは、車輪の上で約 30 秒間走行した場合に訓練されたとみなされました。 ホイールマネージャーソフトウェアプログラム（Med Associates Inc.、フェアファックス、バーモント州、米国）を使用して車輪の回転を連続的に記録し、ホイールの回転数をケージ内のマウスの数で割って、マウスあたりの推定走行距離を求めました。 マウスは 1 日あたり平均 8.1 km (±sem 1.1 km) を走った。 座りがちなグループのマウスは、回し車を持たない従来通りの飼育方法で飼育されましたが、標準的な飼育用品（ドームハウスと巣材）は備えていました。

神経周囲網に対する神経新生の影響を定量化するために、マウスのグループもまた、神経新生を減少させるためにテモゾロミド（TMZ）で処理するか、神経新生を増加させるためにメマンチンで処理した。 対照マウスには0.9%の生理食塩水を注射した。 TMZ は前述のように投与されました 41。 マウスに 25 mg/kg (腹腔内) の用量を週に 3 日連続で 4 週間注射しました。 メマンチンを週に1回、25 mg/kg (腹腔内)の用量で4週間注射した。 最後に、出生後の神経新生の自然な調節因子として年齢も使用しました。 Ｃ５７ｂｌ／６ Ｎ雌マウスを４、８、または１２週齢のいずれかで灌流し、ニューロン周囲ネットを下記のように標識した。

文脈的恐怖条件付けの前に、マウスがハンドラーに対して落ち着くまで、3 ～ 5 日間、すべてのマウスを毎日 5 分間ハンドリングしました。 Ugo Basile (イタリア、ジェモニオ) の状況恐怖条件付けチャンバー (17 cm × 17 cm × 24.7 cm) を騒音低減キャビネット内に設置しました。 調整環境にはショックグリッド床 (バーの間隔は 0.5 cm、直径は 0.2 cm) がありました。 行動は頭上の赤外線カメラを使用して監視され、自動追跡ソフトウェア（ANY-Maze、Stoelting、Wood Dale、IL、米国）を使用して自動的に採点されました。 5 分間の訓練試験中、マウスは 2 分間チャンバー内を探索した後、1 分間隔で 3 回のショック (1 mA、2 秒) が与えられました。 最後のショックから1分後にマウスを調整チャンバーから取り出し、24時間静かにホームケージに戻した。 次に、半数のマウスにランニングホイールを導入しました。 神経新生を操作してから 4 週間後、マウスにショックを与えずに 5 分間の状況的恐怖課題をテストしました。 テスト中の活動レベルに対する運動の直接的な影響を防ぐために、行動テストの前日に回し車をロックしました。 すくみは記憶保持の主な尺度として使用され、少なくとも 1 秒間、呼吸以外の動きが完全になくなることと定義されました。 凍結は ANY-maze ソフトウェア システムによって自動的に計算され、治療条件を知らされていない実験者によって精度が抜き打ちチェックされました。 海馬全体の c-Fos 発現を定量化するために、すべてのマウスを文脈記憶テストの 90 分間灌流しました。

別の実験では、マウスはまず標準条件下で1か月間回し車を使用するか、または車輪なしで飼育された。 次いで、回し車を取り外し、マウスを上記のように状況に応じた恐怖条件付けパラダイムで訓練した。 その後、1 か月後にマウスの文脈記憶をテストしました。 海馬全体の c-Fos 発現を定量化するために、すべてのマウスを文脈記憶テストの 90 分間灌流しました。

手術は、純粋な圧縮酸素を導入する Somnosuite 麻酔薬送達システム (Kent Scientific) を介して送達されるイソフルラン麻酔下で実施されました。 マウスを定位固定ヘッドフレーム (Kopf) に移す前に 5% イソフルラン濃度で誘導し、~2% イソフルランで維持しました。 内部体温は直腸温度計で監視し、恒温パッドで調節しました。 手術の開始時に、鎮痛(アナフェン; 5 mg/kg; 皮下注射)および輸液サポート(乳酸リンゲル液; 皮下注射)を施した。 頭皮を剃り、クロルヘキシジンと70%エタノールのスクラブを交互に使用して洗浄し、その後、正中線に沿って切開し、頭蓋骨を3% H2O2で洗浄した。 Stereodrive ソフトウェア (Neurostar) と組み合わせたロボット定位固定マニピュレーターを使用して、定位固定ソフトウェアが頭蓋骨の平坦性のわずかな欠陥を修正できるように、ブレグマとラムダの位置、および正中線の両側に 2 mm の 2 点を測定しました。 注射およびインプラント部位の座標を取得した後、頭蓋骨にバリ穴を開けました (AP -2.18; ML ± 2.1; 脳表面までの DV)。 Nanoject III 注入システム (Drummond Scientific) に取り付けられ、ミネラルオイルが再充填されたガラス注入針をゆっくりと CA1 (AP − 2.18; ML ± 2.0; DV 1.4) に下げた後、250 nL のウイルス (pGP-AAV1-syn) を注入しました。 -jGCaMP7f.-SV40-WPRE;Addgene)を50nLのパルスでそれぞれ約10秒間散在させ、最後のパルスとそれに続く10分間の期間で針を所定の位置に残して拡散を可能にしました。 10 分間の終わりに、針を脳から徐々に上げてから、光ファイバー インプラント (NA 0.37、コア 200 μm、長さ 2 mm、神経測光) を注射部位 (AP − 2.18) のすぐ横の CA1 に下げました。 ; ML ± 2.1; DV 1.4)。 インプラントは、メタボンドの薄い層を頭蓋骨の露出表面とインプラントの基部の周囲に塗布することによって頭蓋骨に固定されました。 次に、この層を黒色の不透明な歯科用アクリルで覆ってヘッドキャップを形成し、時間をかけて硬化させた後、切開部を縫合材料で閉じた。 次に、マウスを定位固定フレームから取り外し、術後 3 日間追加のアナフェン投与を受けながら 2 週間回復させました。

行動訓練と生体内ファイバー測光記録の前に、マウスを連続 3 日間光ファイバーパッチコードに接続することに慣れさせました。 ファイバー測光は、Bonsai ソフトウェアによって制御される FP3002 神経測光システムを使用して実施されました113。 神経測光システムは、Ca2+ 記録と行動を同期させるために、恐怖条件付けチャンバーを制御する Anymaze ソフトウェア (Stoelting) によって生成された TTL パルスも受け取りました。 励起光は 470 nm で送達され、415 nm チャネルが等吸収性コントロールとして使用されました。 記録は 40 FPS で取得され、2 つのチャネルが交互のフレームでアクティブになり、各チャネルの実効フレームレートは 20/s になりました。 各チャネルが約 50 μW で放射されるように、光度計 (Thor Labs PM100D) を使用して光パワーを校正しました。 行動試験中、ファイバーパッチコード (Doric) はセラミック製の首輪でマウスのファイバーインプラントに固定され、パッチコードの取り付け後 30 秒間はマウスを記録せずに静かに放置しました。 これに続いて、マウスを寝具を備えた清潔な移送ケージ内に単独で座らせながら、５分間のベースライン記録を取得した。 このベースライン記録中に運動活動は記録されませんでした。 5 分の時点で、訓練またはテストのためにマウスを恐怖条件付け装置に移しました。

測光記録を行動データと同期させるために、ANY-maze プロトコルの開始時に TTL パルスが神経測光システムに送信されました。 測光記録はカスタム MATLAB スクリプトを使用して分析されました。 ANY-maze を使用して記録された行動情報は、測光データを通じてインデックスを作成し、タイムスタンプのペア間の最小差に基づいて行動データを調整することにより、分析に統合されました。 すくみ基準の 2 秒より短い動きや不動の発作は分析に含まれませんでした。 等浸透圧 415 nm チャネルからのデータは、光退色を補正するために双指数関数的減衰に適合しました 114。 結果として得られたベクターを使用して、470 nm LED114 を使用して収集されたカルシウム依存データを線形スケール化しました。 ΔF を計算するために、これらの線形スケーリングされたカルシウム依存性データが未処理のカルシウム依存性データから差し引かれました。 得られた値を線形スケールのカルシウム依存データで割って、ΔF/F トレースを生成しました。

ΔF/F の分析では、トレースをベースライン補正しました (式 1)。 これは、5 分間のホーム ケージ記録の中央 3 分間の平均 ΔF/F 値を計算することによって各マウスに対して行われました。 この期間は、取り扱いストレスが結果の値に影響を与える可能性を減らすために、ベースライン期間として選択されました。 次いで、テストセッション中に記録された平均ベースラインΔF/Fと最小ΔF/F値との間の差が、テスト中の各値に加算された。 この補正は、テスト中に ΔF/F が X 軸を下回ったトレースを考慮するために適用されました。 得られた ΔF/F トレースを、曲線下面積 (AUC)、ピーク周波数、および平均ピーク高さについて分析しました。 AUC は操作上、X 軸と ΔF/F トレースの間の合計面積として定義されました。 特定の行動中の AUC の比較は、特定の行動エポックの継続時間の合計によって正規化されました。 ピーク周波数と平均ピーク高さの分析では、分析対象のセッションの ΔF/F 値の中央値を 2 標準偏差上回るピーク検出フィルターを使用しました115。

ここで、hc はホーム ケージのベースライン サンプリング期間中の ΔF/F 値を表すベクトル、test はテスト期間中の ΔF/F 値を表すベクトル、n はテスト ベクトル内のサンプル数を表します。 式 (1) は、テスト セッション中の補正された ΔF/F の計算を表します。

Nestin-cre マウスは、上記と同様の外科的手順を使用して手術を受けました。 ここでは、フロックス化チャネルロドプシン発現 (AAV1-EF1a-ダブルフロックス化-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA) または GFP 発現 (pAAV1-Ef1a-DIO EYFP) AAV ウイルスを歯状回 (AP- 1.94、ML ± 1.25、DV 1.8）。 光ファイバープローブは上記のように埋め込まれました。 次にマウスを 2 週間放置し、回復とウイルス発現を待ちました。 次いで、マウスにタモキシフェン（1日あたり180 mg/kg）を3日間連続で注射し、行動実験を開始する前にさらに2週間放置した。 マウスは、まず、上記のように文脈的恐怖条件付けパラダイムで訓練された。 次に、訓練の 24 時間後、マウスは 0.4 mW、10 Hz の青色光で 1 分間光遺伝学的刺激を受け、その後 3 分間刺激を受けませんでした。 これを連続 5 回繰り返し、20 分間にわたって合計 5 分間の刺激を行いました。 この刺激プロトコルを 2 週間毎日繰り返しました。 行動訓練から 1 か月後、光遺伝学的刺激の完了から 2 週間後に、マウスの文脈的恐怖記憶をテストし、灌流しました。

状況条件付けタスクの完了から 90 分後、マウスをイソフルランで深く麻酔し、次に 0.1 M PBS および 4% ホルムアルデヒドで経心臓的に灌流しました。 脳を抽出し、4% ホルムアルデヒド中で 4 °C で 24 時間後固定しました。 次いで、脳を、0.1 M リン酸緩衝液中の 30% スクロースを用いて、沈むまで 4 °C で 3 ～ 5 日間凍結保護しました。 脳は、c-Fos 実験では 12 系列で、ファイバー測光実験では 6 系列でクライオスタット (Leica CM 1950, Concord, ON, Canada) 上で厚さ 40 μm に切片化されました (ファイバートラックが確実に位置決めされることを保証するため) ）。 切片は、30% エチレングリコールおよび 20% グリセロールを含む 0.1 M PBS 緩衝化不凍液中に保管し、-20 °C で保存しました。

組織切片を、０．１Ｍ ＰＢＳ中、室温で各１０分間、３回洗浄した。 次に切片を、1:500 ヤギ抗 DCX 抗体 (c-18、sc-8066、Santa Cruz Biotechnology、米国テキサス州ダラス)、4% 正常ロバ血清、0.4% のいずれかを含む一次抗体溶液中で 48 時間インキュベートしました。 % Triton X、c-Fos 実験の場合は 0.1 M PBS、またはファイバー測光および PNN 実験の場合は、1:200 ウサギ抗 DCX 抗体 (Cell Signalling、4604 s)、3% 正常ヤギ血清、および 0.003% Triton 0.1M PBS中の-X。 次に、切片を 0.1 M PBS で 10 分間 3 回洗浄した後、1:500 Alexa Fluor 488 抗体 (ロバ抗ヤギ、CLAS10-1116、CedarLane Labs、バーリントン、オンタリオ州、カナダ) を含む二次抗体溶液中で 24 時間インキュベートしました。または 1:500 Alexa Fluor 647 抗体ヤギ抗ウサギ) 最後に、切片を 1:5000 DAPI および 0.1 M PBS で 20 分間インキュベートし、その後、洗浄ごとに 10 分間、0.1 M PBS で 2 回洗浄しました。一次/二次抗体溶液、または DAPI インキュベーション後、組織を室温で穏やかに振動させた後、切片をスライドガラスにマウントし、PVA-DABCO 封入剤を使用して No. 1.5H カバースリップを装着しました。

オリンパス BX63 落射蛍光顕微鏡と 60 倍油浸対物レンズを使用して、海馬歯状回の顆粒および SGZ で DCX 標識細胞を計数しました。 細胞が円形または卵形であり、細胞体が明確に区別できる場合、細胞を計数しました。 顆粒状の細胞質蛍光パターンを持つ細胞は除外されました。 DG 面積は、FIJI を使用して各切片の顆粒細胞層を追跡することにより、DAPI 対比染色に基づいて定量化されました。

組織切片を0.1 M PBSで3回洗浄し、その後、1:500ウサギ抗c-Fos抗体（226003、Synaptic Systems、Gottingen、Germany）、4％正常ヤギ血清、0.4％Triton Xを含む一次抗体溶液に移した。 、および0.1 M PBSで48時間。 次いで、組織切片を０．１Ｍ ＰＢＳ中で１０分間３回洗浄した後、二次抗体溶液に移して２４時間置いた。 二次抗体溶液には、0.1 M PBS を含む 1:500 Alexa Fluor 488 抗体ヤギ抗ウサギ (4412S、Cell Signaling Technologies、米国マサチューセッツ州ダンバーズ) が含まれていました。 最後に、脳切片を 1:5000 DAPI でインキュベートし、その後 0.1 M PBS で 2 回洗浄しました。 各洗浄ステップ、一次/二次抗体溶液、または DAPI インキュベーションでは、組織を室温で穏やかに振動させました。 次に、切片をマウントし、PVA-DABCO 封入剤でカバースリップをかけました。

オリンパス FV3000 共焦点顕微鏡を使用して、c-Fos 標識組織を画像化しました。 すべての取得設定は、画像全体にわたって一定に保たれました。 画像は、10X 対物レンズと 2X 光学ズーム (合計倍率 20X) を使用し、絞りを 1 Airy ユニットに設定して取得しました。 Zスタックのステップサイズは3.64μmでした。 画像は DAPI チャネルと c-Fos チャネルに分離され、FIJI を使用して最大強度が 2D 画像として投影されました。

c-Fos細胞数の変動と偏りを最小限に抑えるために、機械学習ベースのアプローチを検証して使用しました（補足図S1）c-Fos +細胞の顕微鏡写真はセグメント化され、機械学習プログラムIlastik116を使用してバイナリ画像に変換され、定量化されました。フィジーを使用。 まず、実験画像を代表する画像のトレーニング セットが Ilastik にインポートされ、信号と背景を区別するようにトレーニングされました。 この一連のトレーニング画像により、Ilastik は、ピクセル強度、エッジ特徴、テクスチャなどのピクセル特徴と、オブジェクトのサイズ、形状、強度などのオブジェクト特徴に基づいて背景から細胞を分類できるようになりました。 トレーニング後、プログラムをテストするために、DG、CA3、および CA1 領域の 12 匹のマウス (5 匹は座りっぱなし、7 匹はランニング) のサンプル ROI を Ilastik にアップロードしました。 Ilastik で生成された細胞数をグラウンド トゥルース値と比較するために、c-Fos の定量化には経験があるが、Ilastik で生成された細胞数や他の実験者の数については知らなかった 4 人の独立した研究者によって ROI も手動でカウントされました。 。 細胞数は領域ごとに合計され、Ilastik で生成された数と比較されました。 トレーニングと検証の後、実験用の c-Fos 画像がバッチ処理されました。 バイナリ イメージは FIJI にインポートされ、DAPI イメージでオーバーレイされました。 次に、バイナリ画像を使用して細胞を定量化し、FIJI を使用して面積を測定しました。 次に、面積を mm2 に変換しました。 DG、CA3、CA1 領域内の細胞を定量化し、密度 (mm2 あたりの細胞数) として表しました。

PNN は、ウィステリア フロリブンダ レクチン (WFA) 染色によって標識されました。 凍結保護された切片を0.1 M PBSで3回リンスし、次いでCarbo-freeブロッキング緩衝液(VectorLABS)中の0.2% triton-x中で30分間インキュベートした。 次に、切片を、0.05% tween-20 を含む 1 × カーボフリーブロッキングバッファーで希釈した FITC 標識 WFA (VectorLABS) の 1:1000 希釈液で暗所で 24 時間染色しました。 次いで、切片をＰＢＳで３回リンスし、ＤＡＰＩで対比染色した後、マウントし、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（ＶｅｃｔｏｒＬＡＢＳ）でカバースリップをかけた。

WFA 標識神経周囲網を、海馬の歯状回の顆粒帯、CA1 領域、および CA3 領域で手動で数えました。 カウントは、治療条件を知らされていない実験者によって、オリンパス BX63 落射蛍光顕微鏡と 60 倍油浸対物レンズを使用して行われました。 各領域の顆粒ゾーンの面積は、DAPI 対比染色に基づいて定量化されました。 CellSens (Olympus) を使用して、すべての切片から各領域の顆粒細胞層を追跡しました。 DG、CA3、CA1 領域内の細胞を定量化し、密度 (mm2 あたりの細胞数) として表しました。

CA1ニューロン周囲ネットの表面隣接性は、Olympus FV3000共焦点顕微鏡を使用して評価されました。 領域 CA1 の粒状ゾーン内でランダムに選択された 5 つの PNN の画像スタックが各マウスから収集されました。 画像は、開口数 0.95 の 40X 対物レンズと 2.89X 光学ズーム (合計倍率 115.6X) で取得されました。 Zスタックのステップサイズは0.37μmでした。 画像パラメータはすべてのスキャンにわたって一貫していました。 画像スタックは、各 PNN の上半分のみを含むように Z 範囲を設定した FIJI を使用して 2D 画像として投影された最大強度でした。 WFA 信号は、デフォルトのピクセル強度しきい値処理を使用して FIJI で二値化され、個々の PNN が追跡されました。 表面隣接性は、信号のしきい値処理後の WFA 信号の最大連結成分内に存在する WFA 信号の割合として定義されました117。

ウイルスの発現と光ファイバーの配置は、治療条件と実験結果を知らされていない実験者によって検証されました。 CA1 におけるウイルス発現はすべてのマウスに存在しました。 光ファイバーの先端が CA1 の下に配置されていたため、2 匹の対照マウスと 3 匹のランナーは測光実験から除外されました。

統計分析は、GraphPad Prism 8 を使用して実行されました。独立した t 検定、二元配置分散分析、およびピアソン相関が実行されました。 必要に応じて、ANOVA に続いて事後 Newman-Keuls 事後検定を適用しました。 Grubbs の分析は、Ilastik 検証データ内の潜在的な外れ値を特定するために利用されました。 仮説検定は、estimatestats.com118 を使用した c-Fos 定量化の推定統計によって補完されました。 c-Fos 発現には複数の 2 グループ分析を使用しました。 2 つのグループの比較ごとに、効果サイズ (コーエンの d) は、95.0% 信頼区間 (CI; バイアス補正および加速) とともに 5000 個のリサンプルを使用するブートストラップ サンプリング分布を使用して計算されます。 データは、複数の 2 グループ分析のカミング推定プロットを使用してプロットされ、個々のデータ ポイントと比較の効果サイズが示されます。 パワー分析は、神経新生による忘却に関する以前の研究から得られた行動データに基づいて実行されました10。 サンプルサイズが 10 ～ 15 の場合、検出力は約 0.8 ～ 0.9 と推定されました。 すべての統計比較と出力は補足表 S1 ～ S6 に含まれています。

この研究の結果を裏付けるデータは、原稿または補足資料で入手可能であり、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

原稿で報告された結果を生成するために使用されたすべての分析コード、これらの分析の使用方法に関する説明、およびサンプル データセットは、GitHub リポジトリ (https://github.com/dterstege/PublicationRepo/tree/main/) で公開されています。 Evans2022)。

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この研究の資金は、JRE に対する NSERC Discovery Grant (RGPIN-2018-05135) および JRE に対する Brain Canada Early Career Research Capacity Building Grant (4709) によって提供されました。 DJT は、Canadian Open Neuroscience Platform からフェローシップを受け取りました。 GAS は、NSERC、Hotchkiss Brain Institute、Cumming School of Medicine から PDF フェローシップを受けています。

著者 Alexandria Evans と Dylan J. Terstege も同様に貢献しました。

細胞生物学および解剖学部門、ホチキス脳研究所、カミング医学部、HMRB 162、健康科学センター、カルガリー大学、3330 Hospital Drive NW、カルガリー、AB、T2N 4N1、カナダ

アレクサンドリア・エヴァンス、ディラン・J・ターステージ、ギャビン・A・スコット、筒井美緒、ジョナサン・R・エップ

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AE、DJT、JRE が実験を考案し、設計しました。 AE、DJT、GAS が実験を実施しました。 GASとMTが外科的処置を実施した。 AE、DJT、GAS、および JRE が組織学的手順を実行しました。 AE、DJT、JRE が分析を実施しました。 AE、DJT、JRE がこの論文を執筆しました。

ジョナサン・R・エップへの往復書簡

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転載と許可

Evans, A.、Terstege, DJ、Scott, GA 他神経新生を介した可塑性は、状況恐怖記憶の想起中の CA1 におけるニューロン活動の低下と関連しています。 Sci Rep 12、7016 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-10947-w

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受信日: 2022 年 1 月 10 日

受理日: 2022 年 4 月 14 日

公開日: 2022 年 4 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10947-w

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