レチノイン酸の時限送達によるヒト多能性幹細胞からの移植可能なドーパミンニューロンの確実な誘導

Nature Communications volume 13、記事番号: 3046 (2022) この記事を引用

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13 オルトメトリック

メトリクスの詳細

パーキンソン病（PD）に対する幹細胞療法は、ヒト多能性幹細胞（hPSC）から中脳ドーパミン（mDA）ニューロンを生成する一連の技術的に関連した方法を使用したファーストインヒューマン臨床試験に入った。 ここでは、WNT および FGF8 シグナル伝達の代わりにレチノイン酸 (RA) シグナル伝達を利用して中脳運命を特定することにより、代替技術とは主に異なる mDA ニューロンの高収量誘導のためのアプローチを概説します。 正確な濃度が細胞の運命を決定するほとんどのモルフォゲンシグナルとは異なり、中脳の仕様の重要なパラメーターは RA 曝露の持続時間です。 この濃度非依存性パターニングアプローチは堅牢性を提供し、hPSC ライン間のプロトコル調整の必要性を軽減します。 RA 特異的前駆細胞は、in vitro で機能的な mDA ニューロンに速やかに分化し、ラット PD モデルでの移植後に正常に生着し、運動障害を軽減します。 私たちの研究は、細胞療法と疾患モデリングの潜在的な代替ルートを提供します。これは、その堅牢性により、自己細胞または免疫学的に適合した細胞の使用を考慮する場合に特に便利である可能性があります。

胚性幹細胞 (hESC) または人工多能性幹細胞 (hiPSC) の形態のヒト多能性幹細胞 (hPSC) は、ハイスループットの創薬や疾患に利用できる特定のサブタイプのニューロンを産生するための拡張可能な細胞源を提供します。神経変性疾患におけるモデリングまたは細胞置換療法1、2。 腹側中脳（vMB）の中脳ドーパミン（mDA）ニューロンは、パーキンソン病（PD）における比較的選択的な変性のため、特に興味深いものであり、ヒト胎児中脳組織を用いた先駆的な臨床実験により、ドーパミンが移植されたという概念実証が提供されている。ニューロンはドーパミンの神経伝達を回復し、一部の PD 患者に長期的な軽減をもたらすことができます 3。

臨床使用のためのヒト mDA ニューロンの in vitro 誘導方法は徐々に改良されており、幹細胞ベースの PD 治療法は、前臨床動物モデルでの安全性と機能的有効性の広範な評価を経て、同種異系 hESC を使用した臨床試験の刺激的な段階に入っています。または出発物質としてhiPSCを使用します2、4、5、6。 同種異系細胞を使用すると、動物モデルで安全性と有効性を検証した後、同じ細胞製品で多くの患者を治療するために使用できる、大量の冷凍「既製」製剤の生産が可能になりますが、欠点は必要です。移植後の拒絶反応を避けるために1年間の免疫抑制2。 患者特異的 hiPSC は免疫学的観点からは最適ですが、個々の患者に対して臨床グレードの hiPSC を確立し、移植前にこれらの細胞を mDA ニューロン運命を採用するように効果的に誘導するという重要な課題が追加されます。 したがって、最近の症例報告では、細胞治療への自己アプローチが実現可能であるという概念実証が提供されましたが、開発の現段階では患者特異的細胞が日常的な治療法になる可能性は高くありません7。 ヒト白血球抗原 (HLA) に一致する hiPSC 株の使用は、免疫抑制を軽減するための代替戦略ですが、国の人口の大部分をカバーするには、選択された多数の HLA 型の hiPSC 株が必要です8。 もう1つの興味深いアプローチは、免疫抑制を必要とせずに免疫寛容を提供できる万能の「万能」hPSC株を確立することである9が、そのような株がいつ利用可能になり、臨床使用が承認されるかは不明である。 したがって、修復細胞療法が臨床試験で安全で効果的であることが証明されれば、自家およびHLA一致のhiPSC株が日常的な臨床使用のために探索される可能性が高い。 これには、GMP (Good Manufacturing Practice) に準拠した HiPSC 株の標準化された確立とは別に、個々の細胞株に対する面倒な調整を最小限に抑えるために、パターニング剤に応じて細胞株およびバッチの変動性が低い、堅牢な mDA ニューロン プロトコルが必要となります。

現在の最先端の hPSC ベースの mDA ニューロン プロトコルは、同様の発生パターン化シグナルのセットを利用して、mDA ニューロンの運命に向けて hPSC の分化を指示します。 二重 SMAD 阻害 (dSMADi) は、分化初期段階での TGF-β および BMP シグナル伝達の阻害を介して、hPSC が代替の体細胞または胚外運命の選択肢を採用するのを防ぐことにより、神経運命選択を促進するために適用されます 10。 hPSC 由来の神経前駆細胞は、発生パターン形成シグナルの不在下で前脳 (FB) 運命を採用します。 グリコーゲンシンターゼキナーゼ 3β (GSK3β) 阻害剤 CHIR90021 (CHIR) による標準的な WNT シグナル伝達の活性化は、多くの場合 FGF8 とともに適用され、峡部オーガナイザーから発せられる WNT1 および FGF8 シグナル伝達を模倣することにより、中脳 (MB) の領域的同一性を課すために使用されます。 MB-後脳（HB）境界11。 次に、SHH 経路の活性化は細胞を腹側化し、LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ 腹側中脳 (vMB) 底板前駆細胞を誘導するために使用され、これは in vitro での長期培養後または PD 動物モデルへの移植後に機能的な mDA ニューロンに分化することができます 12。 13. 前臨床モデルにおけるドーパミン神経伝達の回復と運動障害の逆転という課題は明らかにこれらの方法を使用して達成できますが、CHIR に対する分化中の hPSC の前後 (AP) パターン化応答は濃度感受性が高く、細胞株間での注意深いプロトコル調整が必要です 12。 14、15、16。 大規模な移植実験の評価では、最適化された CHIR 滴定にも関わらず、実験間のばらつきが vMB の仕様の不正確さと間脳前駆細胞の汚染にさらに関連付けられており、これは FGF817 の尾側化活性の補完または二相 CHIR 処理によって調整できる可能性があります。 (CHIR-ブースト)18 は、間脳汚染を減少させ、細胞のより尾側の EN1+ vMB 同一性を誘導しました。 それにもかかわらず、最近の研究では、HB および脊髄運命を促進する hESC の 4 つの尾側パターン化遺伝子を除去すると、CHIR による vMB 前駆細胞のより一貫した濃度非感受性の指定がもたらされ、CHIR に基づくパターン化が本質的に濃度感受性であるという遺伝的裏付けが提供されることが確立されています。 (bioRxiv のプレプリント)19. したがって、中脳のアイデンティティを特定するために CHIR に依存しない方法の開発は、バッチ間および細胞株間の変動が低い、より堅牢な分化パラダイムをもたらす可能性があります。 また、中脳同一性を課すために使用される高濃度の CHIR は、GSK3β20 に加えて広範囲のキナーゼを阻害すると予測されており、CHIR21 に依存しない分化戦略を検討するさらなるインセンティブを提供します。

峡部オーガナイザーは、吻側神経板の脳領域への領域化が開始された後に確立される二次シグナル伝達中枢です22。 したがって、初期の脳パターン形成には、WNT1 および FGF8 の上流で動作するシグナルが関与しており、特定の観察では、ビタミン A 誘導体レチノイン酸 (RA) がこのプロセスに寄与している可能性があることが示唆されています。 RA の強力な尾側化活動は十分に確立されています 11。 したがって、早期のRA曝露は中枢神経系のより吻側起源を持つニューロンの派生と両立しないと一般に考えられており、RAまたはビタミンAはhPSCベースのmDAニューロンプロトコルでは積極的に回避されることが多い15、23、24。 しかし、ビタミン A 欠乏ウズラ胚では FB および MB マーカーが尾側に拡張していることが研究で報告されており 25、RA 分解酵素 CYP26A1 および CYP26C126 を欠くマウスでは HB が吻側に拡張していることが報告されています。 さらに、マウスでの研究では、FB組織がRA27によってMB様のアイデンティティに再特定され得る初期の一時的な時間枠が定義されています。 これは、RAを適用してhPSC由来NSCに中脳特性を課す可能性を示唆している。 RA は、多能性の溶解を誘導し 28、神経発生の初期段階でナイーブ NSC の成熟を促進することも知られており 29、したがって、hPSC から NSC への急速な変換を促進する可能性があります。 この研究では、SHH経路の活性化と組み合わせた48時間のRAパルスが、in vitroで高収率で機能的なmDAニューロンに分化し、運動欠損を生着して回復するLMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB前駆細胞の迅速な特定を促進することを示す。 PDのラットモデルへの移植後。 最後に、関節リウマチへの曝露時間を調整するだけで、セロトニン作動性ニューロンを効果的に生成することができ、関節リウマチに基づくパターニングが主に信号曝露の持続時間に依存していることを示し、この特性が幅広い適用性を持ち、セロトニン作動性ニューロンを生成するために使用できるという概念実証を提供しました。 hPSC とは異なる臨床的に関連するニューロン サブタイプ。

dSMADi10に応答して神経運命を獲得するように指示されたhESC上のRAの活性を調査するために、我々は、dSMADi条件下で増殖させたGMP準拠のhESC株HS980の培養物を、最初の1、2、3回、200nMオールトランスRAで処理した。 、または4日間の分化（RA1D、RA2D、RA3D、RA4D）（図1a）、免疫ブロッティング、定量的免疫細胞化学、qPCR、またはRNAシーケンス（RNA-seq）によってさまざまな段階での細胞の運命と同一性をモニタリングしました。 以前の研究10と一致して、dSMADiのみの条件で増殖した細胞は、分化条件（DDC）の0〜7日間で多能性状態（OCT4 +）からナイーブNSC状態（SOX1 + PAX6 +）への進行性の移行を受けました（図1b〜d） 。 定量的免疫細胞化学によって明らかになったように、OCT4は徐々にダウンレギュレートされ、〜5 DDCで検出不可能なレベルに近づきました（図1c）。 低レベルでの SOX1 および PAX6 の上方制御は、~3 DDC で発生しました (図 1b)。 OCT4とSOX1は、3〜4のDDCの間の細胞によって共発現されました（図1b、cおよび補足図1a）。これは、dSMADiに応答したhPSCからNSCへの変換が、多能性の発現に関わる注目すべき時間枠を包含することを示しています。そして神経特異的な遺伝子は重複しています。 対照的に、dSMADiおよび200 nM RAで2日以上処理した培養物（dSMADi + RA2D、3D）では、SOX1およびPAX6の誘導が2 DDCで観察され（図1eおよび補足図1a）、OCT4の発現は基本的に 3 つの DDC によって消火されました (図 1b、c、f)。 3〜4 DDC での SOX1 および PAX6 の発現レベルは、dSMADi のみの培養物と比較して dSMADi + RA2D 培養物の方が著しく高かった（図 1b、c、f および補足図 1a）。 7 DDCまでに、SOX1および神経幹細胞マーカーNESTINの発現は、dSMADiのみの培養物とdSMADi+RA2D培養物で同様でした（図1d）。 dSMADi + RA2D培養物のRNA-seq分析は、2 DDCでの多能性遺伝子の全体的なダウンレギュレーションと神経系統特異的遺伝子の上方制御を示唆しました（図1eおよび補足表1）。 内胚葉または中胚葉系列マーカーは上方制御されませんでした（補足図1b）。 細胞をdSMADi + RA2D条件で増殖させた場合、OCT4の迅速な抑制とSOX1の迅速な上方制御は、50〜500 nMのRA濃度範囲内で達成されました（図1g）。 200 nM RAでの細胞の1日間の処理（dSMADi + RA1D）は、迅速なOCT4抑制またはSOX1の迅速な上方制御を促進するのに十分ではなく（図1f）、RAのみ（dSMADiなし）での細胞の処理も不十分でした（補足図1f）。 1c)。 したがって、dSMADiとRA治療を48時間以上組み合わせると、多能性状態からNSC状態への迅速かつスイッチのような移行が促進されます。

dSMADiおよびRAによる治療のタイムラインを含むhPSC分化の概略図。 b デュアルSMAD阻害剤（dSMADi）または2日間のRAパルスを含むdSMADi（dSMADi + RA2D）で分化したESCおよび3日間培養物における、多能性マーカーOCT4および神経外胚葉マーカーSOX1およびPAX6の免疫細胞化学。 c 分化条件（DDC）で示された日にdSMADiまたはdSMADi + RA2Dで分化した培養物におけるSOX1およびOCT4の単一細胞発現の密度プロット。 代表的な分化では、条件および時点ごとに 670 ～ 760 個の細胞が定量化されました。 d 神経前駆細胞マーカーNESおよびSOX1の免疫細胞化学、および示された条件で分化した7 DDCでの培養物の明視野（BF）画像。 e RNAseqに基づくlog10倍は、ESCと比較して、2 DDCでのdSMADi + RA2D培養物における多能性または神経外胚葉運命に関連する遺伝子の発現の変化値を示します。 補足表 1 の P 値と FDR、n = 2 の独立した実験。 f 示された条件で分化したESCおよび3つのDDC培養物のOCT4およびSOX1の代表的なウェスタンブロット。 g dSMADi 条件で増殖させ、指定濃度の RA で 2 日間処理した ESC および 3 DDC 培養物の OCT4 および SOX1 の代表的なウェスタンブロット。 h dSMADi で分化し、示されているように RA で処理した 9 つの DDC 培養物における、前脳 (FOXG1)、前脳および中脳 (OTX2)、後脳 (HOXA2)、および尾側後脳 (HOXB4) 領域を識別するマーカーの免疫細胞化学。 i NSC の地域的アイデンティティに対する RA パルス持続時間の影響の概要。 スケールバー、100 μm。 Arb.units 任意の単位、FB 前脳、MB 中脳、HB 後脳。

異なる時間枠で RA に曝露された hPSC 由来 NSC の領域的同一性を決定するために、9 DDC での培養における単独または組み合わせの発現が FB、MB、または HB の領域的同一性を区別する転写因子の発現を分析しました。 dSMADi 処理は以下のすべての実験に含まれており、実験設定を説明する際にはこれ以上強調されません。 予想通り、RAで処理されていないhPSC培養物（RA0D）では、NSCはFOXG1+/OTX2+/HOXA2- FB様のアイデンティティを獲得しました（図1h）。 同様のFB様特徴がRA1D培養物でも観察されたが、FOXG1+発現レベルは若干低下した（図1hおよび補足図1d）。 興味深いことに、RA2D培養物では、FBマーカーが抑制され、代わりにNSCはFOXG1-/OTX2+/HOXA2- MB様の特徴を発現しました（図1hおよび補足図1d）。 RA3DおよびRA4D培養物では、NSCはそれぞれFOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4-吻側HBおよびFOXG1-/OTX2-/HOXA2+/HOXB4+尾側HBアイデンティティを獲得しました（図1h）。 これらのデータは、48時間のRAパルスがFB運命を抑制し、hPSC由来NSCにMB様の同一性を課す一方、より長い曝露によりHBの同一性がもたらされることを示している（図1i）。

次に、0〜9 DDCの間で培養物をSmoothenedアゴニストSAG30で処理することにより、SHHシグナル伝達を活性化してNSCに腹側の同一性を課し、免疫細胞化学またはRNA-seqによってさまざまな時間枠でRAに曝露された細胞の運命を分析しました（図2a）。 9 DDC で、SAG のみまたは RA1D + SAG 条件で生成された NSC は、FB 特異的マーカー FOXG1、SIX3、SIX6、および LHX2 (図 2b) と腹側マーカー NKX2.1 (図 2a、b) を発現しました。腹側終脳および間脳の選択マーカー 31,32。 RA2D + SAG培養物では、FBマーカーが抑制され、NSCはvMB mDAニューロン前駆細胞に特徴的なLMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+の同一性を採用しました（図2a、b、d）。 RA4D + SAG培養物では、細胞はHOX遺伝子と、HB33の脳運動ニューロン（MN）前駆細胞に典型的な腹側マーカーNKX2.2、PHOX2B、NKX6.1、およびNKX6.2を発現しました（図2a、b、d）。 RNA-seqデータの主成分および階層的クラスタリング分析では、異なる時間枠でRAに曝露された細胞間の明確な分離と幅広い転写変化が示されました（図2cおよび補足図2a）。 まとめると、これらのデータは、まず、RA曝露期間の段階的増加により、hPSC由来NSCに対して尾側領域の脳の同一性（FB->MB->HB）が徐々に増加することを確立します（図1i）。 第二に、SHH 経路の活性化と組み合わせると、48 時間の RA パルスは NSC に LMX1A+/FOXA2+/OTX2+ vMB 様の同一性を与えるのに十分であると考えられます。 48時間のRAパルスが0〜2 DDCの間で開始された場合（補足図2b）、およびSAG治療が0または1 DDCで開始された場合（補足図2c）、LMX1A + / FOXA2 + vMB様アイデンティティの効果的な仕様が達成されました。濃度 ≥50 nM (補足図 2d)。

a RAおよびSHHシグナル伝達活性化因子（SAG）による治療のタイムラインを含むhPSC分化の概略図（上）。 図1aに示すように、すべての培養物はdSMADi条件で分化しました。 +SAG条件で分化させ、1、2、または4日間RAでパルスした培養物における9 DDCでの示されたマーカーの免疫細胞化学（下）。 b +SAGで分化し、示された時間RAで処理した9つのDDC培養物における示された遺伝子の正規化された遺伝子発現（条件あたりn = 2の独立した実験）。 c +SAGで分化し、指定された時間RAで処理した9つのDDC培養物の差次的に発現した遺伝子のヒートマップおよび階層的クラスター化（条件あたりn = 2の独立した実験）。 d 間脳（Di）、中脳（MB）、および後脳（HB）の異なる腹側前駆細胞を定義する遺伝子発現プロファイルの概略図。 e 2つの独立した実験における+SAG + RA2Dで分化した培養物における14 DDCでの示された領域前駆細胞に関連する遺伝子の発現。 f +SAG（コントロール）で分化し、RAまたはCHIR99021で処理した2つのDDC培養物におけるβ-カテニンの代表的な免疫細胞化学（左）およびβ-カテニン核レベルの箱ひげ図（右）。 箱ひげ図データ: 中心線は中央値を定義し、箱は四分位 1 から四分位 3 を示し、ひげは ±1.5 倍の四分位範囲を示します。 n = 227 (対照)、247 (RA)、232 (CHIR99021) 細胞を 3 つの独立した分化にわたって検査し、p 値は対応のない両側 t 検定から導き出しました。 g dSMADi+SAG + RA2D で分化した 14 DDC での培養物中の示されたマーカーの免疫細胞化学。 h 14 DDC での 6 つの独立した mDA 分化に対する 17 遺伝子のパネルの qPCR 分析 (RA2D + SAG カラム; 分化 #1 ～ #6)。 mDA サンプルを、前脳 (RA0D + SAG、n = 2) または後脳 (RA4D + SAG、n = 2) の前駆細胞の同一性に分化した培養物と比較しました。 i 4つの異なるhPSC株にわたる+RA2D + SAGで分化した14のDDC培養物におけるFOXA2、LMX1AまたはNKX2.1を発現する細胞の割合の定量化（値、平均±SD、n = 3〜4）。 スケールバー: パネル (a、g) では 100 μm、パネル (f) では 25 μm。

LMX1A+/LMX1B+/FOXA2+/OTX2+ の同一性は、mDA ニューロンを生成する vMB 前駆細胞の分子的特徴として長い間考えられていましたが、この同一性は視床下核 (STN) ニューロンを生成する尾側間脳の腹側前駆細胞にも共有されることが示されました 17,32 (図2d)。 BARHL1、BARHL2、PITX2、および NKX2.1 は STN 系統によって選択的に発現されるため、間脳 STN 前駆細胞と vMB 前駆細胞を区別するために使用できます 32。 14日後のRA2D + SAG培養物の分析により、大多数のLMX1A+細胞がFOXA2、OTX2、およびLMX1BならびにvMBマーカーCORIN34を共発現していることが示されました（図2g; LMX1A+FOXA2+：92.5％±3.3、OTX2+：97.3） % ± 1.7、平均 ± SD、n = 4)。 この段階では、細胞の少数のサブセットが、有糸分裂後 mDA ニューロンの初期マーカーである NURR1 (図 2g) の発現を開始していました 35。 RNA-seqデータは、BARHL1、BARHL2、PITX2、およびNKX2.1の発現が無視できることを示し（図2e）、まれにLMX1A +またはLMX1B + NSCがNKX2.1、PITX2、またはBARHL1を共発現しました（図2g; NKX2.1+： 14 個の DDC 培養で 2.1% ± 2 (n = 3)、PITX2+: 1.4 ± 0.8 (n = 2)、平均 ± SD)。 NKX2.2、PHOX2B、PHOX2A、および NKX6.1 の単独または組み合わせの発現は、HB 腹側の脳運動ニューロン (MN) およびセロトニン作動性ニューロン (5HTN) を生じさせる前駆細胞を定義します 33,36、または派生する眼球運動ニューロン 37 および GABA 作動性ニューロン 38 MBのmDAニューロンの外側（図2d）。 RNA-seqデータは、RA2D + SAG培養物におけるこれらのマーカーの発現が低いことを明らかにし（図2e）、免疫細胞化学によって決定されたように、14 DDCでNKX2.2、PHOX2A、PHOX2B、およびNKX6.1を発現した細胞はほとんどありませんでした（図2g）。 14 DDCで分離されたRA2D + SAG培養物の6つの生物学的複製のqPCR分析は、一貫したvMB仕様と不適切な局所マーカーの低発現を示しました（図2h）。

峡部オーガナイザーから発せられるWNT1およびFGF8シグナ​​ル伝達は、MB39、40におけるEN1およびEN2発現の尾側高から吻側低への勾配を課す。 EN1、EN2、WNT1、FGF8、および狭窄マーカーPAX2、PAX5、およびPAX8は、14 DDCで非常に低いレベルまたは検出不可能なレベルで発現しました（図2e）。 CHIR99021による標準的なWNTシグナル伝達の活性化は、β-カテニンの核への移行に関連しています12,21（図2f）。 2 DDC〜14 DDCのESC培養物では、RA治療に応答したβ-カテニンの核蓄積はなく（図2f）、RAに応答したWNT1またはWNT応答遺伝子AXIN2、FGF8の誘導もありませんでした（図2f）。 2eおよび補足図2e）合わせて、これは、RAおよびSAGによって誘導されたLMX1A + / FOXA2 + / OTX2 +細胞がEN1 - / LOW吻側様vMBアイデンティティを獲得し、vMB運命の指定がWNT1、FGF8または誘導とは独立して起こり得ることを示唆していますhPSC培養物における峡部オーガナイザー様細胞の観察。

次に、追加の 1 つの hESC 株 HS401 と 2 つの hiPSC 株 SM55 および SM56 について、RA2D + SAG 処理に対するパターン化応答を比較しました。 14 DDCで分析した各細胞株について、RA曝露の濃度や時間を調整する必要がなく、高収率でLMX1A + / FOXA2 + / OTX2 + / NKX2.1- vMB前駆細胞の一貫した誘導が観察されました（図2iおよび補足図3）。これには通常、尾側化に CHIR が使用される他の mDA ニューロン プロトコルを使用してパターニング剤の再滴定が必要になります 15。 まとめると、これらのデータは、RA に基づく分化が、実験間の一貫性が高く、細胞株の変動性が低い、堅牢で再現性のある vMB の仕様を促進することを示唆しています。

RA の強力なパターニング活性を理解するために、RA の濃度の変化に応じたパターニング出力を調べました。 これらの実験では、RA2D + SAG 条件で培養した細胞を 100 ～ 800 nM の範囲の RA に曝露し、細胞の領域的同一性を 9 DDC で分析しました。 200 ～ 400 nM RA に曝露された培養物では、NSC の大部分が LMX1A+/NKX2.1- vMB 同一性を発現し、間脳 LMX1A+/NKX2.1+ 同一性または NKX2.2+/LMX1A- HB 様を発現した細胞はほとんどありませんでした。アイデンティティ (図 3a、c)。 9 DDCの一部のLMX1A +が非常に低レベルでNKX2.2を共発現したことは注目に値します（補足図2c）。これは、NKX2.2がin vivoの発生初期段階でvMB前駆体で一時的に発現されることを示すデータと一致しています37。 LMX1A+/NKX2.1- vMB 前駆細胞は、RA 濃度を 100 nM に低下させるか、RA を 800 nM に増加させた場合にも生成されましたが、収率は低下しました (図 3c)。 CHIR を使用して vMB アイデンティティを特定すると、細胞は 1 μM C​​HIR に応答して LMX1A+/NKX2.1- vMB アイデンティティを獲得しましたが、濃度が低下すると、NSC の領域アイデンティティは前間脳 LMX1A+/NKX2.1+ 特性に移行しました。 0.8および0.6μMまで（図3b、c）、または濃度が1.2および1.4μMに上昇した場合には、後部NKX2.2+/LMX1A-推定HB同一性へ（図3b、c）。 これらのデータは、vMB の領域同一性の特定が RA 濃度の変化に対して比較的耐性があり、代わりに堅牢な vMB パターニングの中心となるのは RA 曝露期間であることを示しています。

a〜c 腹側前脳（NKX2.1+LMX1A+）、中脳（NKX2.1−LMX1A+）または後脳（NKX2.2+）を定義するマーカーの発現に対するRA（a）またはCHIR99021（b）濃度の変化の影響。 dSMADi+SAG で分化した 9 つの DDC 培養、および対応する NKX2.1+LMX1A+ および NKX2.1−LMX1A+ 集団の定量化 (条件ごとに n = 3 つの独立した分化)。 値、平均±SD (c)。 d dSMADiで分化した1つのDDC培養物におけるCYP26A1発現に対するRA濃度（50、100、300、500、および1000 nM RA）の影響（2つの独立した分化からのデータ）。 e dSMADiで分化し、RAなし、または300、500、または1000 nMのRAで2日間パルスした培養物におけるCYP26A1の時間的発現プロファイル（2つの独立した分化からのデータ）。 f SAGで分化し、RA状態を示した培養物における9 DDCでのNKX2.1、LMX1A、およびPHOX2Bの発現に対する500 nM R115866阻害剤によるCYP26活性の阻害の影響。 g RA1D + SAG 条件および異なる濃度の CYP26 阻害剤 R115866 の存在下で分化した 9 つの DDC 培養物における示された遺伝子の相対遺伝子発現 (2 つの独立した分化からのデータ)。 h、i dSMADi と指定の条件 (500 nM 9-cis-RA、13-cis-RA および TA; 200 nM EC23) および 200 nM EC23 の存在下で分化した培養物における 9 DDC での NKX2.1、LMX1A、および PHOX2B の免疫細胞化学または 500 nM R115866 が存在しない。 j RAとCYP26A1の間の調節相互作用の概略図。 スケールバーは100μm。

CYP26 ファミリーの遺伝子 (CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1) は、酸化を通じて RA を代謝するシトクロム p450 ファミリーの酵素をコードしています 41。 CYP26A1 は最も吻側の神経外胚葉によって発現され、神経発達の初期段階での HB アイデンティティの吻側拡張の防止に寄与しています 26。 また、HB の前後パターン形成では、CYP26 タンパク質の誘導を介した自己強化分解による RA シグナル伝達の負のフィードバック制御が、RA 勾配を形成し、RA レベルの変動を緩衝するために中心的役割を果たしています 42,43。 我々は、hPSC培養物におけるCYP26A1のRA濃度依存性活性化および適応的一時的発現プロファイルを観察した（図3d、e）。 これは、変化したRA入力がCYP26A1によるRAターンオーバー速度の一致する変化によって緩衝される可能性があるため、RAに対するhPSCのロバストなパターン形成応答に対する妥当な機構的理論的根拠を提供する。 これを調査するために、DDC 0 ～ 3 の間で選択的アンタゴニスト R11586644 で CYP26 活性を阻害した後の、時限的な RA 曝露に応じたパターニング出力を調べました。 500 nM R115866 で処理した RA1D + SAG または RA2D + SAG 培養物では、細胞はそれぞれ 9 DDC で NKX2.1+ FB 同一性または LMX1A+/NKX2.1- vMB 同一性の代わりに PHOX2B+ HB 同一性を獲得しました（図 2）。 3f）。 これらの実験ではHOXA2およびHOXB4が誘導され、尾側HBの同一性を示唆しています（図3g）。これは、CYP26機能が損なわれていない場合に4日間のRA曝露後に獲得される領域の同一性（図1h）に対応します。 R115866濃度が100 nMに低下すると、FB運命は抑制されましたが、培養物にはLMX1A + / NKX2.1- vMB細胞とPHOX2B + HB細胞の混合物が含まれており（図3gおよび補足図4a）、おそらくFBの部分的な阻害を反映しています。 CYP26A1 は中間尾側効果を生み出します。 重要なことに、R115866およびSAGのみによる細胞の処理はNKX2.1 + FB運命を抑制せず（図3f）、R115866の強い尾側化効果がRA依存性であることが確立された。

オールトランス RA と同様に、9-シス RA、13-シス RA、および生体異物 RA 類似体であるタザロテン酸 (TA) は、CYP26 媒介酸化の基質です 45,46。 500 nMのこれらの類似体に細胞を48時間曝露すると、LMX1A+/NKX2.1- vMBの同一性を課すことによりオールトランスRAのパターニング活性が模倣され（図3hおよび補足図4b）、CYP26活性の阻害が生じた。 PHOX2B + HBアイデンティティへの移行中（図3h）。 合成 RA 類似体 EC23 は、CYP26 媒介酸化に耐性があると予測されており 47、オールトランス RA を 200 nM の EC23 で置き換えると、EC231D + SAG 条件または EC232D + SAG 条件で増殖した細胞は、PHOX2B+ HB 同一性を採用しました。 CYP26の阻害なし（図3iおよび補足図4a）。 滴定実験により、EC23がLMX1A + / NKX2.1- vMB細胞を誘導できることが示されましたが、これは不正確であり、濃度を20倍に低下させ、24時間のみ細胞を処理する必要がありました（補足図4c）。 まとめると、これらのデータは、時限的なRA曝露に応答したAPパターニング出力が、応答するhPSCにおけるCYP26A1のRA濃度依存性活性化に大きく依存していることを確立し、RAにおける変化したRA入力に対するロバスト性と耐性を説明するための機構的理論的根拠を提供する。仲介された vMB 仕様 (図 3j)。

mDA ニューロンのユニークな特徴は、最初は非ニューロン床板 (FP) 細胞に由来するため、前駆細胞はニューロンに分化する前にニューロンの潜在能力を獲得する必要があることです 34,48。 これらの vMB 成熟段階を区別するマーカーはほとんどありませんが、経時的な SHH の下方制御と前神経 bHLH タンパク質の上方制御はこの移行と相関しています 48。 DDC 9、12、14、および 21 時に単離された RA2D + SAG 処理細胞の RNA-seq 分析により、汎 FP マーカーである SHH、CORIN、ARX、VTN、FERD3L、NTN1、SLIT2、SULF2、および ALCAM の発現がピークに達したことが示されました。 DDC 12〜14 頃に減少し、その後減少しました（図 4a、補足図 5a、および補足表 2）。 逆に、前神経性bHLHタンパク質をコードするNEUROG2、NEUROG1、NEUROD4、およびASCL1は、21 DDC（図4a）、mDAニューロンマーカーNR4A2（NURR1）およびTH、および汎ニューロンマーカーDCX、TUBB3、およびSTMN2（図4aおよび補足表2）。 免疫細胞化学分析により、SHH発現は21 DDCと比較して14 DDCでより高く、NEUROG2+前駆細胞の数がこの期間にわたって増加したことが確認されました（図4b）。 14〜21 DDCの間でHuC / D +ニューロンの漸進的な蓄積があり（図4c、d）、21 DDCまでに、DAPI +細胞の約30％がRA2D + SAG培養物中のHuC / D +ニューロンを占めました（図4d） 。 これらの多くは TH の発現も開始していました (図 4c)。 LMX1A+/NKX2.1- vMB前駆細胞を特定するためにCHIR + SAGを適用した場合（図3b）、細胞は約17 DDCで神経新生を開始しました（図4c、d）。これは以前の研究と一致しています13、15。 ２１ＤＤＣでは、ＨｕＣ／Ｄ＋ニューロンは全細胞の約１０％を構成し、ＴＨを発現するニューロンはほとんどなかった（図４ｃ、ｄ）。 CHIR + SAG処理培養物を9〜16 DDC15、17の間でFGF8b処理で補完した場合にも、同様の結果が観察されました（図4c）。 これは、RA 特異的 vMB 前駆細胞が早期に神経発生を開始し、細胞集団レベルで未熟な FP 状態から神経原性 mDA ニューロン前駆細胞状態への比較的協調的な変換を受けることを示しています。

a – r dSMADi + RA2D + SAG（a、b、e – r）またはdSMADi + SAGで分化され、RA、CHIR99021、またはCHIR99021 + FGF8条件（c、d）を示した培養物の分析。 RNAseq に基づく log2 は、14 DDC と比較した 21 DDC でのフロアプレートの同一性および神経発生に関連する遺伝子発現の変化値の倍数変化を示します。 補足表 2 の P 値および FDR 値、2 つの独立した実験からのデータ (n = 2)。 b 14 および 21 DDC での SHH、LMX1A、および NEUROG2 免疫細胞化学。 c 示された条件における、17 DDCでのニューロンマーカーHuC/Dおよび21 DDCでのドーパミン作動性ニューロンマーカーTHの免疫細胞化学。 d 示された条件における14、17、および21 DDCでのHuC / D +ニューロンの定量化（n = 2）。 e – i 示されたマーカー（e、f、h）の免疫細胞化学、およびFOXA2またはLMX1Bを発現するTH+細胞（それぞれn = 4およびn = 5）（g）、およびドーパミン作動性（TH+、n = 7）、GABA作動性の免疫細胞化学DDC 33 ～ 35 の (GABA+、n = 6)、運動ニューロン (PRPH+、n = 7)、およびセロトニン作動性 (5-HT+、n = 7) ニューロン。 i 値、平均 ± SDTH/Tuj および (h) の 5-HT/Tuj 画像は、トリプル 5-HT/TH/Tuj 免疫細胞化学に対応します。 j、l 40〜45のDDC培養物における示されたマーカーの免疫細胞化学。 k 30および40個のDDC TH+ニューロンにおける神経突起の長さ（中心線、平均、ペアワイズウィルコクソン検定からのp値）および神経突起分岐定量化（中心線、平均）のヴァイオリンプロット、時点あたりn = 40ニューロン。 m mDA 分化中の mDA マーカーの qPCR (n = 3、n = 2 の 21 DDC を除く)。 n 35 ～ 40 DDC での EN1 を発現する TH+ 細胞の定量 (n = 3)。 (m,n) のデータは、42 個の DDC 培養物の上清中のノルアドレナリン (NA)、ドーパミン (DA)、およびセロトニン (5-HT) の HPLC 検出の平均 ± SD です。 p コントロール (n = 12) または KCL 誘発ドーパミン放出後 (n = 12)、および全細胞溶解物 (n = 6) における 42 DDC での培地中のドーパミン レベルの定量。 値は平均値 ± SEM、対応のない両側 t 検定からの p 値として表示されます。 q 細胞付着記録。40 ～ 45 DDC での細胞からの自発的活動電位 (左) と分離された自発的活動電位 (右) を示します。 灰色の矢印は自発的なスパイクを示します。 r 40個のDDCニューロンにおけるビオシチン標識ニューロン(左)および誘発スパイク列(右)におけるTHの免疫細胞化学。 分化タイムラインの概略図。 スケール バー: 100 μm (b、c、e、h、j) および 50 μm (f、l、r)。

RA指定TH + ニューロンは、30〜45 DDCの間の軸索突起の進行性伸長と分岐を伴う、徐々により高度なニューロン形態を獲得しました（図4e、j、k）。 TH+ニューロンは、30〜35 DDCでmDAニューロンマーカーLMX1B、LMX1A、FOXA2、NURR1、およびOTX2を発現しました（図4e〜g）。 まれな細胞のみが 35〜40 DDC で Ki67 またはホスホヒストン H3 を発現しました（補足図 5b）。これは、長期培養における有糸分裂活性が低いことを示しています。 すべてのニューロンの約 80% が 35 DDC で TH+ を発現しました (図 4h、i)。 ニューロンの約10％がGABAを発現し（図4h、i）、これらのいくつかはTHを共発現しました（補足図5b）。 5-HT または MN マーカー PRPH を発現するまれなニューロンのみが検出されました (図 4h、i)。 この研究で調べた4つのhPSC株はすべて、長期培養において高含有量のTH+ニューロン（全ニューロンの約60〜80％）を生じさせることが確認されました（補足図5c）。

時間的mRNA発現分析により、40 DDCでのESC培養物におけるEN1の顕著な上方制御が明らかになり（図4m）、TH+ニューロンのごく一部（〜15％）が免疫細胞化学に基づいて検出可能なEN1を発現した（図4l、n）。 したがって、未熟なRA指定の吻側様vMB前駆細胞は無視できるEN1発現を示しますが（図4m）、これはEN1が時間の経過とともに分化中のmDAニューロンで上方制御されることを示しています（以下も参照）。 細胞はまた、免疫細胞化学（図4lおよび補足図5b、d）またはmRNA発現（図4m）によって決定されるように、40 DDCでmDAニューロン成熟マーカーDAT、GIRK2、SYNAPTOPHYSIN、CALB1、SOX6、VMAT2およびALDH1A1を発現した。 42 DDC での高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 分析により、ニューロンはドーパミンを生成および放出したが (図 4o、p)、セロトニン (5-HT) やノルアドレナリン (NA) は生成しなかった (図 4o) ことが証明されました。 hPSC 由来細胞が自発活動電位、誘発活動電位、電位依存性 Na+ および K+ 電流を獲得する時間は、in vitro での mDA ニューロンの成熟状態を評価するための別の尺度となります 49。 RA2D + SAG 培養では、電位依存性 Na+ および K+ 電流を示すパッチ細胞の数は 35 DDC では低かったが、38 DDC で顕著に増加し、その後はほぼ一定のレベルを維持しました (補足図 6)。 (図 4q) または誘発活動電位 (図 4r) は 40 ～ 45 DDC で記録されました。 まとめると、これらのデータは、RA特異的vMB前駆細胞が、in vitroで高収率で機能的なmDAニューロンに分化し、発達中の脳幹のmDAニューロンのすぐ近くで生成されるニューロンサブタイプの汚染がほとんどないことを確立します（図4s）。

RA2D + SAG に応答して特定された vMB 前駆細胞の in vivo での性能を決定するために、PD50 の前臨床ラット モデルに vMB 調製物を移植しました。 vMB前駆細胞は14 DDCで単離され（図4s）、以前に記載されているように内側前脳束への片側6-OHDA損傷を有する無胸腺（ヌード）ラットの線条体に移植されました17（補足図7a）。 移植から7か月後、免疫組織化学分析により、9匹のラットすべてが、背外側線条体および前頭前皮質を含むDA標的領域の広範な神経支配を有するニューロンが豊富な移植片を生存していることが示されました（図5a）。 移植片には、ヒトマーカーHuNuで同時標識された多数のTH+ニューロン（移植片あたり4300±47個のTH+ニューロン、図5b）が含まれていました（図5c、dおよび補足図7b）。 移植片由来のTH +ニューロンは、FOXA2、LMX1A / B、PITX3、NURR1、およびEN1も共発現し（図5e-j）、移植後もmDA表現型を採用したことを示しています。 TH + ニューロンの約70％が移植後に検出可能なEN1を発現し、RA特異的mDAニューロンの大部分がin vivoでの分化および成熟後にEN1を発現したことを示しました（図5n）。 TH+ニューロンの70％以上は、mDAニューロンの治療用A9サブタイプに豊富に含まれるマーカーであるPITX3、GIRK2およびSOX6も共発現しました51（図5i〜l、n）。 A9の同一性は、周囲の背外側線条体を神経支配するTH +線維によってさらに裏付けられました（図5aおよび補足図7c）。 神経支配は前頭前皮質でも検出され、少数のTH+ニューロンは、mDAニューロンのA10サブタイプに富むマーカーであるCALB1（20.5％±4.7、平均±SD）を発現しました51（図5m、n）。 TH+ ニューロンの機能は、薬物誘発性および自発運動テストを使用して評価されました。 アンフェタミン誘発の回転および足踏みテスト。移植後 7 か月での機能回復が実証されました（図 5o ～ q）。 まとめると、これらの結果は、RAおよびSAGによって特定されたhPSC由来のvMB前駆細胞が、正常に生着し、関連する標的領域に投射を拡張し、PDの動物モデルにおける運動障害をこれまでと同等の程度に回復させる機能的なmDAニューロンに分化することを示している。 CHIRベースのパターニングプロトコルを使用して生成された細胞から報告されています13、17、52、53。

a-m vMB製剤を線条体に移植してから7か月後の片側6-OHDA損傷ラットの免疫組織学的分析。 DABで開発されたhNCAM染色で標識された宿主脳への移植片由来の神経支配の概要、および前頭前皮質（PFC）および背外側線条体（DLstr）に向かうヒト神経線維伸長の拡大。 b 線条体および黒質（SN）におけるTH発現。 線条体全体にわたる TH 免疫反応性と、病変側の SN における TH 発現の欠如に注目してください (右)。 c – m 移植片内の示されたマーカーの免疫組織化学。 n EN1、SOX6、GIRK2 (n = 6 ラット)、PITX3 または CALB1 (n = 4 ラット) を発現する移植片における TH+ 細胞の割合の定量化。 データは平均値±SDとして表されます。 ベースラインのアンフェタミン誘導性回転スコアが病変後および移植後7ヶ月の同側回転数が1分あたり5回以上であるラットにおける1分あたりの正味回転数の定量化（n = 5ラット）。 データは平均値 ± SEM、ウェルチの不等分散両側 t 検定からの p 値として表示されます。 p すべての移植動物（n = 9 ラット）の移植前（実線）および移植後 7 か月（破線）のアンフェタミン投与後の経時的な回転行動。 q 病変後および移植後 7 か月後の対側の足の使用を優先します。 データは平均±SEMとして表した(n = 9ラット)。 病変後に分析された同じラットを、移植後 7 か月後に分析しました。 スケールバー: (a) では 1000 μm。 左と(b)、(a)では100μm。 右; (d、e、f、I、j、k) で 25 μm。 10 μm (c、g、h、l、m)。

私たちの研究はmDAニューロンのRAベースの特定に焦点を当てていますが、時限RA曝露はhPSCからの臨床的に関連するさまざまなタイプのニューロンの特定に広く適用できるはずです。 たとえば、SHH経路の活性化と組み合わせたRAへの長期曝露（3日以上）は、NKX2.2+ HB様前駆細胞（図2a、b）を誘導し、脳PHOX2B+運動ニューロン（MN）とセロトニン作動性ニューロン（5HTN）を連続的に生成することが知られています。 ) マウスとヒトの発育中 36,54。 5HTN は幅広い生理学的プロセスと行動を調節し、さまざまな精神疾患の病態生理学に関与している 55,56 ため、時限的な RA 治療がヒト 5HTN の生成にも戦略を提供できるかどうかを検討しました 16,55 (図 6a) ）。 MN が生成される時間枠は、前駆細胞における NKX2.2 と MN 決定基 PHOX2B の共発現によって定義されます 57。 RA4D + SAG培養物では、NKX2.2とPHOX2Bは〜9〜16 DDCの間で共発現され（図6b）、PHOX2B + / NKX2の存在によって決定されるように、この期間にわたって分化中のMNの漸進的な蓄積が存在しました。 １７ＤＤＣにおける２−細胞、および１９ＤＤＣにおけるＰＨＯＸ２Ｂ＋／ＰＲＰＨ＋／ＩＳＬ１＋／ＩＳＬ２＋およびＰＨＯＸ２Ｂ＋／ＴｕＪ１＋ニューロン（図６ｂ）。 17DDCでは、ほとんどのNKX2.2+前駆細胞でPHOX2Bが下方制御され、5HTN系統マーカーGATA3を発現する細胞が出現し始めました（図6b）。これは、この時期に前駆細胞がMNから5HTNへの運命スイッチを受けたことを示しています。 培養中の早期誕生MNの量を減らすために、分化したニューロンは未熟な前駆体と比較して培養皿に再付着する能力が低いことを示したため、24 DCCで解離ステップを導入しました（図6a）。 この方法を使用すると、34 DDCで培養中のPHOX2B + MNの数を〜6％に減らすことができ（図6c、d）、総HuC / D +ニューロンの〜60〜65％が5-HTおよび分子を発現する培養物を達成しました。 GATA3、LMX1B、トリプトファンヒドロキシラーゼ2（TPH2）、セロトニントランスポーター（SERT）、5-HT1A自己受容体（5-HT1AR）などの5HTNに特徴的なマーカー（図6c〜e）。 まとめると、これらのデータは、ヒト 5HTN の効果的な in vitro 誘導に RA 曝露の一定期間を適用できるという概念実証を提供します。

MN および 5HTN 生成中の分化条件とプロセスのタイムラインの概略図。 b RA4D + SAGで処理した培養物における9および17 DDCでのNKX2.2、PHOX2B、およびGATA3、および19 DDCでのTuj1、PRPH、PHOX2B、およびISL1/2の免疫細胞化学。 c 34 DDC でのセロトニン (5-HT) と MAP2、GATA3、または PHOX2B の免疫細胞化学。 d PHOX2B、GATA3、または GATA3 および 5-HT を発現する HuC/D+ 細胞の 34 DDC での定量化 (n = 3 の独立した分化)。 データは平均 ± SD、35 ～ 45 DDC での 5HTN の示されたマーカーの免疫細胞化学として表されます。 スケール バー: パネル (b、c) では 100 μm、パネル (e) では 50 μm。

幹細胞研究の中心的な目的は、高収率および高純度で目的の細胞産物を再現可能に生産する、シンプルかつ堅牢な分化技術の開発です。 この研究では、CHIR99021またはCHIR99021およびFGF8の代わりにRAシグナル伝達を利用して、既存の最先端のhPSCベースのmDAニューロンプロトコルとは主に異なる、移植可能なヒトmDAニューロンを誘導するための代替アプローチを提示します。 hPSC 由来の神経前駆細胞に対する MB の同一性。 SHH 経路の活性化と組み合わせると、48 時間の RA パルスにより、間脳または後脳のアイデンティティを発現する細胞の汚染が無視できる程度で、一貫した仕様の vMB 前駆細胞が得られます。 RA 特異的 vMB 前駆細胞は、正常な mDA ニューロンの発達と一致する進行的な分化と成熟のステップを経て、長期培養において機能的特徴を発現する mDA ニューロンを高収率で生成します。

我々は、CHIR99021による標準的なWNTシグナル伝達の漸進的な活性化に匹敵する方法で、RAが漸進的により尾側の脳の同一性を課すのに十分であることを示す。 ただし、RA ベースのパターニングの際立った特徴は、領域の仕様が信号曝露時間によって設定され、パターニングの応答が RA 濃度の変化に対して比較的鈍感であることです。 RA は、この点において、WNT12、16 を含む、異なる濃度で異なる運命を指定するほとんどの発生モルフォゲンシグナルとは異なります。 負のフィードバック ループに RA 入力の可変レベルの許容範囲を割り当てることができます。これにより、CYP26A143 による RA 回転率の変化を一致させることで、RA 入力の変動が相殺されます。 CYP26A1の薬理学的阻害後にパターン形成反応が破壊されるため、この調節回路は信頼性の高い領域仕様にとって重要です。 したがって、これらの規制上の特徴は、分別手順に堅牢性と再現性をもたらし、バッチ間およびライン間の調整の必要性の削減に貢献するはずです。 これにより、複数の hiPSC 株が臨床使用や in vitro での疾患モデリングに考慮される場合の分化が容易になる可能性があり、また、多数の細胞が必要な場合にはスケールアップの取り組みも容易になる可能性があります。 さらに、mDA ニューロン運命の促進とは別に、RA 曝露の長期化が頭蓋 MN および 5HTN の生成に使用できることを示し、分化パラダイムの幅広い適用可能性を示しています。 我々の研究は、WNTおよびFGF8シグナ​​ル伝達とは無関係に中脳運命を特定するにはRAが十分であることを確証しているが、以前の研究ではmDAニューロンのhPSCベースの誘導にRA、WNT1、FGF8a、およびSHHの組み合わせを利用していた59。 この研究では、長期培養で約 1% の FOXA2+/TH+ ニューロンの収率が観察されましたが、分化手順から WNT1 を選択的に省略すると、FOXA2+/TH+ ニューロンが失われました。 したがって、この特定の設定における RA の使用は、mDA ニューロンの運命を特定するには十分ではなく、代わりにこれを WNT シグナル伝達に割り当てることができます。

我々は、dSMADi治療に関連した初期のRA曝露も、OCT4+/SOX1- hPSCからOCT4-/SOX1+ NSCへの迅速かつスイッチのような変換を促進することを発見した。 この活性は集団レベルで細胞に同調効果をもたらし、おそらく、RA 治療終了後約 2 ～ 3 週間で RA に特異的な vMB 前駆細胞が FP 状態から神経原性状態へ比較的協調的に移行する理由を説明していると考えられます。 RAによる多能性の解消は、多能性遺伝子の再活性化や散発性細胞が多能性の形質をより長期間維持する潜在的なリスクを最小限に抑えるため、安全性の観点からも望ましい。 ただし、そうは言っても、広範な前臨床評価の後、または先行する mDA ニューロンプロトコルを使用して開始された臨床実験から、細胞の過剰増殖などの有害な副作用の報告がないことを強調することが重要です60、61。

6-OHDA 損傷ラットの線条体に移植すると、RA 特異的 vMB 前駆細胞が生着し、長期生存する成熟 mDA ニューロンに分化し、運動機能を回復します。 移植片に存在する TH+ ニューロンの大部分は EN1 を発現していましたが、これは特に EN1 がマウスの mDA ニューロンの長期生存に必要であるためです 62,63。 我々のインビトロ分析では、RA特異的vMB前駆体におけるEN1の発現が無視できる程度であることが確立されているため（図2e、4m）、移植に使用した調製物中のEN1を検査しませんでした。 したがって、このバッチには EN1 発現が欠如しており、生成される EN1+/TH+ ニューロンの数に影響を与える可能性があると正式に結論付けることはできません。 しかし、EN1 の上方制御は in vitro で比較的若い mDA ニューロンのサブセットで観察されるため、移植片中の EN1+/TH+ ニューロンの割合が高いことは、時間の経過とともに成熟する RA 特異的 mDA ニューロンにおける EN1 の進行性活性化を反映していると考えられる。 移植片における SOX6、PITX3、および GIRK2 の定量により、RA 特異的 mDA ニューロンの大部分が A9 様のサブタイプ同一性を発現していることがさらに示されました。 したがって、RA ベースの vMB 仕様は、PD における細胞療法用の細胞を生成するための潜在的な代替ルートを提供します。 この最初の移植研究では、若い FP 状態で移植するために vMB 前駆細胞を単離しました。これにより、RA ベースのプロトコル機能を使用して生成された mDA ニューロンが、CHIR ベースのプロトコルを使用して生成された mDA ニューロンと同等であるという重要な概念実証が提供されました 13,17,52 ,53。

RA 特異的細胞は比較的同期して分化するため、今後の実験では、他の成熟段階で単離された vMB 前駆細胞の移植によって mDA ニューロンの収量、機能、神経支配、または移植片の組成が改善される可能性があるかどうかを探ることが楽しみになるでしょう 64。 MB パターニング剤としての RA の同定は、CHIR99021/FGF8 ベースの mDA ニューロン プロトコルの進歩的な開発で以前に示されているように、パターニング シグナルの組み合わせ使用が調製の品質を向上させることができるかどうかを調査するための追加のツールをさらに提供します 13、17、65。 例えば、最近の CHIR プロトコルでは、FGF817 または 2 番目の CHIR ブースト 18 を利用して、尾側の EN1+ vMB 前駆細胞の同一性を促進することで標本中の望ましくない間脳前駆細胞を減少させ、移植結果を改善しました。 RA 特異的前駆細胞は、間脳細胞の重大な汚染なしに EN1 より吻側に似た vMB アイデンティティを獲得し、これにより良好な移植結果も得られます。 これに関連して、成人 MB の吻尾軸に沿って mDA ニューロン サブタイプの位相分布が不均一であり、吻側に A9 サブタイプが集中していることは注目に値します 51,66。 これがニューロンの誕生の位置的起源にどの程度関係しているかは不明のままであるが、RA は吻側のような vMB のアイデンティティを課す一方、CHIR と FGF8 はより尾側のような vMB のアイデンティティを促進するため 17,18 、サブパターン化するかどうかを調査することは興味深いであろう。これらのシグナルを組み合わせて使用​​することにより、vMB 前駆細胞の生成を利用して、移植片内の mDA ニューロンのサブタイプ構成を調節できます。 さらに、RAは峡部オーガナイザーから発せられるシグナルの上流で作用するため、hPSC培養物におけるRAおよびWNTシグナル伝達の連続活性化は、正常な胚発生をよりよく模倣し、hPSC由来mDAの収量と機能効率の両方に関して有益である可能性があると考えられる。移植後のニューロン。

ヒト ESC 株 (HS980 および HS401)67 は、Dr. によって提供されました。 アウティ・ホヴァッタ氏とフレドリック・ラナー氏（カロリンスカ研究所）。 ヒト iPSC 株 (SM55 および SM56) は、Pamela J. McLean 博士および Simon Moussaud 博士 (メイヨー クリニックの再生医療センター内の神経再生研究室) によって提供されました。 初代ヒト皮膚線維芽細胞の単離（患者の同意を得て取得）および iPSC の生成は、IRB プロトコール（IRB 09-003803）に基づいてメイヨークリニック治験審査委員会によって承認されました。 細胞は、iPS-Brew XF培地（Miltenyi Biotech）中の組換えヒトビトロネクチン（VTN）（Thermo Fisher Scientific）でコーティングされたプレート上で維持されました。 細胞をEDTA (0.5 mM)で継代し、プレーティング後の最初の24時間、ROCK阻害剤を最終濃度10μMで培地に添加しました。 すべての細胞株はマイコプラズマ汚染の検査で陰性でした。 すべての分化は、特に明記しない限り、hESC 株 HS980 を使用して実行されました。

PSC 分化の場合、80 ～ 90% コンフルエントの PSC 培養物をリン酸緩衝食塩水 (PBS) で 2 回洗浄し、EDTA (PBS 中 0.5 mM) で 5 ～ 7 分間処理し、PBS 中の単一細胞懸濁液に再懸濁しました。 細胞を 400 g でスピンダウンし、N2B27 培地 (DMEM/F12: Neurobasal (1:1)、0.5 × N2 および 0.5 × B27 (プラスビタミン A) サプリメント、1 × 非必須アミノ酸、1% GlutaMAX、55 μM に再懸濁しました) β-メルカプトエタノール - すべて Thermo Fisher Scientific 製）、5 μM SB431542 (Miltenyi Biotech) および 2.5 μM DMH1 (Santa Cruz Biotech) (二重 SMAD 阻害)、および 10 μM ROCK 阻害剤 (播種後の最初の 48 時間) を含みます。 RA および RA 類似体ベースの実験では、VTN (2 μg/cm2) およびフィブロネクチン (FN) (2 μg/cm2) (Sigma) でコーティングされた表面に細胞を 60,000 ～ 80,000 細胞/cm2 の密度で播種し、細胞 20,000 個を播種しました。 CHIR99021実験の場合は/cm2。 SAG1.3 (Santa Cruz Biotechnology)、CHIR99021 (Miltenyi Biotech)、オールトランス RA、9-シス RA、13-シス RA、タザロテン酸、R115866 (すべて Sigma)、EC23 (Amsbio) を濃度および時点で使用しました。結果セクションに記載されています。 オールトランス RA および RA 類似体を DMSO (10 mM ストック溶液) に溶解し、遮光状態で等分し、1 か月以内に使用しました。 アリコートを -20 °C で保存し、1 回使用しました。

mDA ニューロン分化の場合 (図 4 の概略図を参照)、神経前駆細胞を幹細胞継代ツール (Thermo Fisher Scientific) を使用して 9 DDC で機械的に解離させ、10 μM ROCK 阻害剤を含む N2B27 培地に 1:3 の比率で播種しました (最初の 48 時間)解離後) VTN および FN コーティングされた表面に。 ドーパミン作動性ニューロンの in vitro 最終分化では、アキュターゼ (Thermo Fisher Scientific) を使用して細胞を 23 または 24 DDC で解離し、VTN + FN + ラミニン (各 2 μg/cm2) (Sigma) 上にプレーティングしました (600,000 ～ 800,000 細胞/cm2)。 BDNF (10 ng/ml) および GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech)、アスコルビン酸 (0.2 mM) (Sigma)、10 μM ROCK 阻害剤 (Miltenyi Biotech) を添加した B27+ 培地 (Thermo Fisher Scientific) で表面をコーティング(解離後の最初の 48 時間)。 電気生理学および神経伝達物質含有量分析のために、細胞を、BDNF (10 ng/ml) および GDNF (10 ng/ml) (Miltenyi Biotech)、アスコルビン酸 (0.2 mM) (Sigma) を補充した B27 電気生理学培地 (Thermo Fisher Scientific) で増殖させました。実験前の少なくとも 5 日間、10 μM ROCK 阻害剤 (解離後最初の 48 時間)。 培地は 2 ～ 3 日ごとに定期的に交換されました。

MN および 5HTN の分化 (図 6 の概略図を参照) では、細胞を 5 μM SB431542、2.5 μM DMH1、および 10 μM ROCK 阻害剤を含む N2B27 培地に再懸濁し (播種後最初の 48 時間)、VTN + FN (それぞれ 2 μg/cm2) 60,000 ～ 80,000 細胞/cm2 の密度で表面をコーティングしました。 最初の 4 日間、細胞を 200 nM の RA または EC23 で処理しました。 200 nM SAG1.3 を 2 ～ 9 DDC の分化培地に添加しました。 培養物を幹細胞継代ツールを使用して 9 DDC で機械的に解離し、10 μM ROCK 阻害剤を含む N2B27 培地に再懸濁し (解離後最初の 48 時間)、VTN + FN コーティング表面に 1:3 の比率で播種しました。 5HTN の最終 in vitro 分化では、アキュターゼを使用して細胞を 23 または 24 DDC で解離し、10 ng を補充した B27+ 培地中の VTN + FN + ラミニン (各 2 μg/cm2) でコーティングされた表面にプレーティングしました (600,000 ～ 800,000 細胞/cm2)。 /ml BDNF、10 ng/ml GDNF、0.2 mM アスコルビン酸、10 μM ROCK 阻害剤 (解離後の最初の 48 時間)、および 10 μM DAPT。 培地は 2 ～ 3 日ごとに定期的に交換されました。

細胞を12分間固定しました。 室温（RT）で4%パラホルムアルデヒド/PBS中で洗浄し、PBST（0.1% Triton-X100を含むPBS）で3回洗浄し、ブロッキング溶液（PBS中3% FCS/0.1% Triton-X100）で室温で1時間ブロックしました。 ）。 次に細胞を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、続いて蛍光団結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。 一次抗体とフルオロフォア結合二次抗体の両方をブロッキング溶液で希釈しました。 適切な Alexa (488、555、647) 結合二次抗体 (Molecular Probes) を使用しました。 免疫組織化学は前に記載したように実施した17。使用した一次抗体および二次抗体を補足表4に示します。

免疫蛍光画像は、ZEN 2011 ソフトウェアを備えた共焦点 Zeiss LSM 700 顕微鏡、ZEN2 ソフトウェアを備えた Zeiss AxioImager M2 蛍光顕微鏡、および Molecular Devices ImageXpress Micro (ソフトウェア バージョン 6.0) で取得し、オープンソースの ImageJ/Fiji (v1.53) で分析しました。 、CellProfiler (v3.1.5) または MetaXpress (v 5.0)。

全RNAはQuick-RNA Mini Prep Plusキット(Zymo Research)を用いて単離した。 cDNAは、Maxima First Strand cDNA合成キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して調製した。 定量的リアルタイム PCR は、Fast SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を使用して 7500 Fast Real Time PCR システム サーマル サイクラーで実行されました。 遺伝子発現の分析は 2-ΔΔCt 法を使用して実行され、相対的な遺伝子発現は GAPDH 転写レベルに対して正規化されました。 使用したプライマーを補足表 3 に示します。

イルミナの RNA シーケンスでは、Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies) を使用して、Agilent RNA 6000 Pico チップで RNA の完全性を測定しました。 Poly-A 選択を備えた Illumina TruSeq Stranded mRNA キットをライブラリー構築に使用しました。 サンプルは、2×51 セットアップの NovaSeq6000 および HiSeq2500 機器でシーケンスされました。 Bcl から FastQ への変換は、CASAVA ソフトウェア スイートの bcl2fastq_v2.19.1.403 を使用して実行されました。 リードはヒトゲノムアセンブリにマッピングされ、STAR (v 2.6.1a)68 を使用して GRCh37 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/] が構築されました。 遺伝子レベルの存在量は、StringTie269 を使用して FPKM として推定されました。 各遺伝子に対する読み取りの要約 (つまり、カウント) は、featureCounts70 を使用して計算されました。 複数の ENSEMBL 遺伝子 ID が既知の HUGO 遺伝子シンボルごとに合計されました。 差次的な発現は、対数変換された FPKM 値から推定されました。 差次的発現の統計的有意性は、p 値と誤検出率 (R パッケージ v. 3.6.2) を使用し、不等分散を仮定し、ウェールズ自由度修正を適用して、R 関数 t 検定で推定されました。 実験設定に応じて、設計はペアであるかペアではないと考えられます。 得られた示差発現の p 値には、それぞれの倍率変化値が伴っていました。 p 値は、Benjamini と Hochberg の方法により誤検出率 (FDR) を計算することにより、複数の検定用に調整されました 71。

ヒートマップ プロットと PCA 視覚化は、[https://www.evinet.org/]72 にあるオンライン ツール (ベータ版) を使用して、R パッケージ heatmaply と関数 princompas バックエンドの標準パラメーター設定を使用して実行されました。

細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（ThermoFisher Scientific）を補充したRIPA緩衝液（Sigma）中で溶解し、振盪しながら氷上で30分間インキュベートした。 溶解物を遠心分離（20,000 g、4℃で20分間）によって清澄にし、タンパク質濃度をビシンコニン酸（BCA）アッセイによって測定しました。 タンパク質ライセートを、2.5% 2-メルカプトエタノールを含む LDS バッファー (Thermo Fisher Scientific) に再懸濁し、95 °C で 5 分間変性させました。 4 ～ 15% SDS ポリアクリルアミドゲル (Bio-Rad) のレーンあたり 15 ～ 30 μg のタンパク質をロードし、Trans-Blot Turbo System (BioRad) を使用してニトロセルロース膜 (BioRad) に転写しました。 メンブレンをブロッキング溶液（0.1％ Tween-20（TBST）を含むTBSおよび5％脱脂粉乳）中で室温で1時間インキュベートし、続いて一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートしました。 室温でTBSTで3回洗浄した後、膜をHRP結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。 HRPの検出は、化学発光基質SuperSignal West Dura基質によって実行され、シグナルはChemiDoc Imaging System (Bio-Rad)で検出された。 イムノブロッティング用の一次抗体は補足表 4 にリストされています。

42 個の DDC 培養物中のノルアドレナリン (NA)、ドーパミン (DA)、およびセロトニン (5-HT) の濃度を、電気化学的検出を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によって測定しました。

dSMADi+RA2D で分化した 42 DDC の培養物を、生理的溶液 (140 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、pH 7.4 の HEPES (20 mM) で緩衝) または高 K+ 溶液 (生理的溶液) 中でインキュベートしました。 56 mM K+ を使用し、Na+ イオンの濃度は同じ総浸透圧を維持するために比例して減少しました)。 20 分後、インキュベーション溶液を収集し、神経伝達物質含有量の分析に使用しました。 細胞の神経伝達物質の含有量を測定するために、細胞を H2O 中で溶解しました。 インキュベーション溶液と細胞溶解物を 0.1 M 過塩素酸で除タンパクし、15 分後に除タンパクしました。 氷上でインキュベートした後、サンプルを 20,000 g で 15 分間 2 回遠心分離しました。 前に説明したように73。 タンパク質濃度はBCA法により測定した。 次に、サンプルを、HTEC500 (Eicom、京都、日本) および 20 μl ループを備え +4 °C で動作する CMA/200 冷蔵マイクロサンプラー (CMA Microdialies、ストックホルム、スウェーデン) で構成される HPLC システムで分析しました。 ガラス状炭素作用電極の電位は、Ag/AgCl参照電極に対して+450 mVでした。 分離は200 × 2.0 mmのEicompak CAXカラム(Eicom)で行った。 移動相は、メタノールと、４０ｍＭ塩化カリウムおよび０．１３ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）（３０：７０、ｖ／ｖ）との混合物であった。 クロマトグラムは、コンピューター化されたデータ収集システム Clarity (DataApex) を使用して記録され、統合されました。

平均神経突起長は、TH+ ニューロンの免疫蛍光画像上で ImageJ パッケージ 74 [https://imagej.net/plugins/neuronj] の NeuronJ プラグインを使用して定量化されました (倍率 10 倍、ズーム 0.5)。 ニューロンあたりの分岐数は、高倍率 20 倍での TH+ ニューロンの免疫蛍光画像を使用して計算されました。

35 ～ 60 日経過したニューロンを含むスライドを、電気生理学培地 (Neurabasal Medium, Electro; Thermo Fisher Scientific) を含む記録チャンバーに配置しました。 記録のために、60倍の対物レンズ（オリンパス、東京、日本）を備えたDIC顕微鏡（Scientifica、アックフィールド、英国）を使用してニューロンを視覚化しました。 P-87 Flaming/Brown マイクロピペットプーラー (Sutter Instruments、ノバト、カリフォルニア州、米国) で引っ張られたパッチ ピペット (電圧クランプ記録の場合は抵抗 3 ～ 5 MΩ、電流クランプ記録の場合は 5 ～ 10 MΩ) に、154 のいずれかが充填されました。電圧クランプ記録の場合は mM NaCl 溶液、電流クランプ記録の場合は 8 mM ビオサイチンを含む 120 mM KCl 溶液。 シグナルは、Axon MultiCalmp 700B アンプで記録され、Axon Digidata 1550B デジタイザー (Molecular Devices、サンノゼ、カリフォルニア州、米国) で 20 kHz でデジタル化されました。 アクセス抵抗とピペット静電容量が補正されました。 細胞に取り付けられた電圧クランプ記録は、低域 2 Hz/高域 1 kHz でバンドパス フィルター処理され、過分極後の現象を自発的活動電位とみなしました。 スパイクパターンを評価するために、電流クランプモードで記録されたニューロンを-60 mVの膜電位に保持しました。 レオベース電流を決定するために、閾値近くの電流ステップが適用され、次に、レオベース電流に比例する 1 秒の電流ステップが適用されました。 Na+ および K+ 電流の存在は、-60 mV の保持から 10 mV の間隔で電圧ステップを適用することにより、電圧クランプ モードで測定されました。 電流は、ベースライン (電圧ステップ開始の 10 ms 前) から、特徴的な速い Na+ 電流成分のピークまたは遅い K+ 電流成分のピークまで測定されました。 電気的特性は、カスタム作成された Matlab (MathWorks、米国マサチューセッツ州ナティック) スクリプト [https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY] を使用して抽出されました。 記録後、上記のようにスライドを固定し、染色し、画像化した。 ビオサイチンは、ストレプトアビジン Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific) を使用して視覚化しました。

すべての動物手順は欧州連合指令 (2010/63/EU) に従って実行され、実験動物の使用についてはマルメ/ルンド倫理委員会 (Malmö/Lunds djurförsöksetiska nämnd) およびスウェーデン農務省 (Jordbruksverket) によって承認されました。 ）。 成体の雌の無胸腺「ヌード」ラットを Harlan/Envigo Laboratories (Hsd:RH-Foxn1rnu) から購入し、12 時間の明暗サイクル下で餌と水を自由に摂取できるように飼育しました。 動物は、実験開始時に最低でも１６週齢であった（１８０ｇ）。 外科的処置および右内側前脳束 (MFB) への 6-ヒドロキシドーパミン (6-OHDA) の片側単回注射による黒質線条体経路の損傷は、以前に記載されているように実行されました 75。 簡単に言うと、フェンタニルとメデトミジン（20：1）の溶液を腹腔内注射（1 mL/kg; Apoteksbolaget、スウェーデン）を使用して、全身麻酔下で外科的処置を実施した。 「ヌード」ラットにおける黒質線条体経路の損傷は、ブレグマに対する次の座標までの遊離塩基濃度 3.5 mg/mL で 4 μL の量の 6-ヒドロキシドーパミンを右 MFB に片側注射することによって誘発されました: A/P - 4; M/L -1.2; D/V (硬膜から) -7.5。 病変の重症度は、6-OHDA 注射の 4 週間後に、自動システム (Omnitech Electronics) 17 を使用して 90 分間記録されたアンフェタミン誘発回転とステッピング テスト 13 によって測定されました。 アンフェタミン誘導回転は、2.5 mg/kg 塩酸アンフェタミン (Sigma) の腹腔内注射によって誘導されました。 6-OHDA MFB 損傷から 8 週間後、前述のように線条体への分化 14 日目に「ヌード」ラットに総用量 150,000 個の hESC 由来前駆細胞を投与しました 75。 簡単に説明すると、体積 2 μL の細胞懸濁液 (濃度 75,000 細胞/μL の細胞を 1 μL/分の速度で注入し、その後 2 分間の拡散時間で注入した) をブレグマに対して次の座標で線条体に注入しました。 : A/P + 0.5; M/L -3; D/V (硬膜から) -4.5; フラットヘッドに調整しました。 アンフェタミン誘発の回転および足踏みテストを移植後 7 か月で評価しました。 動物は行動分析後に灌流され、免疫組織化学のために処理されました。

P 値は、スチューデントの t 検定、ウェルチの不等分散 t 検定、またはペアワイズ ウィルコクソン検定を使用して計算され、2 つのグループの統計分析のために実行されました。 使用された統計手法は、対応する図の凡例に示されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

図のソースデータ。 1〜6および補足図。 1 ～ 7 はこのペーパーに付属しています。 この原稿で報告された RNA-seq データセットは、受託番号 GSE147404 で Gene Expression Omnibus に寄託されています。 ヒトゲノムアセンブリ、GRCh37 を構築 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/]。

ニューロンの電気的特性を分析するためのスクリプトとデータは、[https://zenodo.org/record/6367837#.YjSC3DUo9PY] で入手できます。

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博士たちに感謝します。 hESC 株については Outi Hovatta および Fredrik Lanner (カロリンスカ研究所)、Dr. HiPSC ラインのメイヨー クリニック (ジャクソンビルのメイヨー クリニック) 再生医療センター内の神経再生研究室、Pamela J. McLean および Simon Moussaud 氏。 私たちは、ストックホルムのゲノミクスプロダクションにある国家ゲノミクスインフラストラクチャーからの、超並列シーケンシングと UPPMAX 計算インフラストラクチャーへのアクセスに関する支援に感謝します。 この研究は、クヌートおよびアリス・ワレンバーグ財団 (KAW2011.0661、KAW2012.0101; JE)、スウェーデン研究評議会 (2013-4155、2017-02089; JE)、スウェーデン戦略研究財団 (SRL10-0030; JE) からの助成金によって支援されました。 JE)、ヒャルンフォンデン (FO2017-0037、F02019-0154、F02021-0159; JE)、パーキンソン フォンデン (1189/19、1257/20、1326/21; JE)、ノボ ノルディスク財団 (NNF20OC0062355; JE)、カロリンスカ研究所 ( JE）。

カロリンスカ研究所が提供するオープンアクセス資金。

これらの著者は同様に貢献しました: José M. Dias、Andrew F. Adler、Mariya Kozhevnikova。

細胞分子生物学部、カロリンスカ研究所、171 65、ストックホルム、スウェーデン

ジャンナ・アレクセンコ、ホセ・M・ディアス、マリヤ・コジェヴニコワ、アシュウィニ・ジェガリ、スヴィトラーナ・ヴァシロフスカ、ヨハン・エリクソン

発達および再生神経生物学、実験医科学部、ワレンベルグ神経科学センター、ルンド大学、221 84、ルンド、スウェーデン

アンドリュー・F・アドラー、サラ・ノルブラント、マリン・パーマー

ルンド幹細胞センター、ルンド大学、22184、ルンド、スウェーデン

アンドリュー・F・アドラー、サラ・ノルブラント、マリン・パーマー

カロリンスカ研究所生物科学栄養学科、141 83、ハディンゲ、スウェーデン

ジョジーナ・アンナ・ヴァン・ルンテレン＆マリー・カーレン

カロリンスカ研究所生理学および薬理学部、171 65、ストックホルム、スウェーデン

Takashi Yoshitake & Jan Kehr

Pronexus Analytical AB、ブロンマ、スウェーデン

ヤン・ケール

カロリンスカ研究所神経科学部門、171 65、ストックホルム、スウェーデン

マリー・カーレン

カロリンスカ研究所、微生物学、腫瘍および細胞生物学部、171 65、ストックホルム、スウェーデン

アンドレイ・アレクセイエンコ

Science for Life Laboratory、171 21、ソルナ、スウェーデン

アンドレイ・アレクセイエンコ

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ZA: 構想と研究デザイン、hPSC の分化と特性評価、データ分析と解釈。 JMD および MK: hPSC の操作、分化と特性評価、データの解釈。 AFA: in vivo 移植、行動分析、SNJAvL の貢献による移植データ分析、および MC: 電気生理学およびデータ分析。 AJ および AA: RNA-seq データ分析とバイオインフォマティクス。 SV: hPSC の分化と特性評価。 JK と TY: HPLC 分析。 MP の設計と移植研究の監督。 JE: ZA、JMD、AFA、MP とともに監督、​​構想と研究デザイン、原稿執筆

ヨハン・エリクソンへの通信。

この論文で提示された結果に関する特許出願 (第 2006792.2 号) は、カロリンスカ研究所イノベーション AB の支援を受けて JE と ZA によって提出されました。 MP は Parmar Cells AB の所有者であり、以下の特許 WO2016162747A2、WO2018206798A1、および WO2019016113A1 の共同発明者です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Alekseenko、Z.、Dias、JM、Adler、AF 他時限レチノイン酸送達によるヒト多能性幹細胞からの移植可能なドーパミンニューロンの確実な誘導。 Nat Commun 13、3046 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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受信日: 2021 年 2 月 1 日

受理日: 2022 年 5 月 11 日

公開日: 2022 年 6 月 1 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30777-8

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